Surveillance Strategies and Prevention of Flavivirus Infections in (Zoo-) Birds in Germany

Two flaviviruses (Usutu virus (USUV) and West Nile virus (WNV)) are known to cause disease and deaths in the avifauna as well as in humans. USUV and WNV circulate in an enzootic cycle between birds (amplification/reservoir hosts) and competent mosquitoes (vectors). Mammals such as equines and humans are classified as dead-end hosts and can display severe clinical signs. USUV has spread across the African and European continents, while WNV is present worldwide (with the exception of Antarctica). Since their introduction into Germany (USUV 2010/2011; WNV 2018), both viruses are considered endemic and are spreading continuously. USUV has spread throughout Germany, while WNV occurs primarily in eastern Germany but also shows clear tendencies to spread to the north-west.

This highlights the need for serological and molecular biological surveillance of WNV and USUV in susceptible hosts (birds) as well as dead-end hosts (horses) to track current events. In addition, this doctoral thesis addresses the possibility of protecting valuable zoo and breeding birds in endemic areas from severe WNV infections using an approved inactivated equine vaccine.

The first study (Manuscript I) focused on sampling zoo birds (mainly owls) from the Wildpark Schwarze Berge, located in northern Lower Saxony on the border to Hamburg, over four years (2018–2022). USUV genomes were found during the study period, in addition to serological USUV detections. In certain bird species, USUV neutralizing antibodies (nAbs) were tracked over the entire four-year period. These collected data are therefore very important and unique as so far no studies have tracked the progression of USUV antibodies in naturally infected birds over several years. Furthermore, the introduction of WNV was recently demonstrated serologically for the first time, confirming the steady spread of this virus to the north-west of the country.

The WNV seroprevalence in a clinical horse cohort in an endemic area (Berlin/Brandenburg, BE/BB) was compared to that of a previously unaffected area (North Rhine-Westphalia, NRW) covering the years 2018 to 2020 (Manuscript II). The serum samples did not yield molecular evidence of WNV, USUV, or tick-borne encephalitis virus (TBEV). Serologically, however, nAbs were detected against all three viruses. In NRW, there was no evidence of WNV circulation, while in BE/BB an increasing seroprevalence from 8.16 % to 13.77 % was detected. This was accompanied by the detection of eight WNV IgM-positive horses, suggesting recent WNV infections. Interestingly, however, typical clinical signs were visible in only half of the infected horses. This highlights the difficulty of detecting WNV infections in horses based solely on clinical signs and illustrates the need for differentiating laboratory diagnostics.

The third study (Manuscript III) focused on the comparison of partial USUV Sanger sequencing with second- (Illumina) and third-generation (MinION) USUV whole-genome sequencing (WGS). RNA sequencing performed on the Illumina platform yielded the lowest error rates and the most comprehensive data. These results were compared to those from two other MinION sequencing methods, which differed in having a target-enrichment step prior to sequencing. The amplicon-based enrichment step resulted in significantly better data generation with concomitant time and cost savings. For the rapid molecular surveillance of USUV outbreaks in Germany with in-depth phylogenetic analyses, the inexpensive and fast MinION amplicon sequencing platform is therefore, a reliable method.

The MinION amplicon methodology was further utilized in a USUV isolate characterization (Manuscript IV). From 2017 to 2021, a total of 118 USUV-positive birds were sequenced, revealing a nationwide distribution of the USUV lineages Africa 3 and Europe 3 in Germany, whereas the lineage Europe 2 co-circulated only in the eastern part of Germany. Phylogenetic analyses were performed to calculate the estimated time to the most recent common ancestor (TMRCA) for each of the three lineages and revealed a one- to three-year gap between the calculated first occurrence of each lineage and the first molecular evidence. These results highlight the well-established bird surveillance programs in Germany. In addition, two clusters of lineage Africa 3 were found to have a long-time lag, suggesting evolutionary dynamics. For lineage Europe 3, three clusters were calculated that were temporally closely-related, suggesting several independent introductions.

The last study (Manuscript V) focused on the WNV vaccination of zoo birds to prevent severe infections. The study was conducted at the Zoo Erfurt in Thuringia, where WNV-related deaths occurred for the first time in 2020. Depending on the birds’ weight, a dose of 0.3 mL, 0.5 mL, or 1.0 mL was applied intramuscularly three times at three week-intervals or following adapted vaccination schedules. The pilot study illustrated the innocuousness of the inactivated equine vaccine in exotic bird species and resulted in good antibody responses in most of the birds vaccinated with 1.0 mL. The serological studies indicated that nAbs (against USUV and WNV) from previous natural infections resulted in enhanced immune responses, in consequence of which co-protections may be suspected.

Studies described here prove that zoo birds can be excellent sentinels for USUV and WNV. At the Wildpark Schwarze Berge, USUV genomes and nAbs were present in zoo birds over four consecutive years. Moreover in 2022, the first introduction of WNV was detected in the zoo. Surveillance studies in horses have demonstrated that horses in West Germany have not been affected by WNV infections so far, whereas in East Germany a steadily increasing number of animals were exposed to the endemic virus. Furthermore, an amplicon-based sequencing method was established and validated for usage in future surveillance programs. The Oxford Nanopore platform was used for USUV WGS, which allowed the calculation of the estimated TMRCAs for the prevailing USUV lineages, revealing a one- to three-year gap between introduction and detection. At the Zoo Erfurt, a WNV vaccination pilot study was conducted for the protection of zoo birds. The inactivated equine vaccine resulted in good antibody responses, effectively protecting the vaccinated birds from WNV infections in the following transmission season. Moreover, the vaccine was consistently well tolerated by the birds, underlining the harmlessness of this vaccine for birds.

Krankheits- und Todesfälle können durch die beiden Flaviviren Usutu-Virus (USUV) und West-Nil-Virus (WNV) ausgelöst werden. Die Viren zirkulieren in einem enzootischen Kreislauf zwischen Vögeln (Amplifikationswirte) und kompetenten Mücken (Vektoren), führen aber auch in Pferden und Menschen, die als Fehlwirte gelten, zu teils massiven klinischen Symptomen bis hin zum Tod. USUV hat sich im Zuge der Globalisierung über den afrikanischen und europäischen Kontinent hinweg verbreitet, während WNV weltweit (mit Ausnahme der Antarktis) vertreten ist. Die Viren gelten seit ihrem Eintrag nach Deutschland (USUV 2010/2011, WNV 2018) als endemisch und breiten sich fortwährend aus. Während USUV deutschlandweit zu finden ist, tritt WNV vorrangig im Osten des Landes in Erscheinung und zeigt derzeit eine deutliche Ausbreitungstendenzen gen Nordwesten, einhergehend mit enzootischen, epizootischen sowie epidemischen Ausbrüchen.

Dies unterstreicht die Notwendigkeit serologischer und molekularbiologischer Überwachung von WNV und USUV in empfänglichen (Fehl-) Wirten (Vögeln und Pferden), um das aktuelle Geschehen zu verfolgen. Außerdem befasst sich diese Doktorarbeit mit der Möglichkeit wertvolle Zoo- und Zuchtvögel in Endemiegebieten vor einer schweren WNV-Infektion mithilfe eines zugelassenen inaktivierten Pferdeimpfstoffes zu schützen.

Die erste Studie (Manuskript I) befasste sich über vier Jahre hinweg (2018–2022) mit der Beprobung von Zoovögeln (vorwiegend Eulen) aus dem Wildpark Schwarze Berge, der im Norden Niedersachsens an der Grenze zum Bundesland Hamburg liegt. Über den gesamten Beprobungszeitraum hinweg gab es molekulare und serologische USUV-Nachweise, die in einzelnen Individuen über vier Jahre hinweg verfolgt werden konnten. Diese erhobenen Daten sind sehr bedeutsam, da es bisher keine Studien zu dem Verlauf von USUV-Antikörpern in natürlich infizierten Vögeln über mehrere Jahre hinweg gab. Serologisch konnte kürzlich der Nachweis des Eintrages von WNV in den Wildpark erbracht werden, der die stetige Ausbreitung dieses Virus gen Nordwesten bestätigt. Weiterhin konnte mit dieser Arbeit die Relevanz von Zoovögeln als sinnvolle Sentinel-Spezies für die Überwachung beider Flaviviren unterstrichen werden.

In der zweiten Studie (Manuskript II) konnte erstmals nach Auftreten von WNV in Deutschland die WNV-Seroprävalenz einer Pferdepopulation im Endemiegebiet (Berlin/Brandenburg, BE/BB) vergleichend mit einem bisher noch nicht betroffenen Gebiet (Nordrhein-Westfalen, NRW) in den Jahren 2018 bis 2020 dargestellt werden. Ein molekularbiologischer Nachweis von WNV, USUV oder Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSMEV) gelang in den Serumproben nicht. Jedoch wurden serologisch neutralisierende Antikörper (nAk) gegen alle drei Viren nachgewiesen. In NRW konnte zu keinem Zeitpunkt die Zirkulation von WNV gezeigt werden, während in BE/BB eine steigende WNV-Seroprävalenz von 8,16 % auf 13,77 % aufgezeigt wurde. Dies ging einher mit der Detektion von acht WNV-IgM-positiven Pferden, was auf eine kürzlich erfolgte WNV-Infektion schließen lässt. Interessanterweise zeigte nur die Hälfte der Pferde typische klinische Symptome. Dies verdeutlicht die Schwierigkeit, eine WNV-Infektion in Pferden allein aufgrund der auftretenden klinischen Symptomatik zu erkennen und verdeutlicht die Notwendigkeit einer differenzierenden Labordiagnostik.

In der dritten Studie (Manuskript III) wurden die bereits etablierte und in vorangegangenen Studien angewandte partielle Sanger-Sequenzierung mit neuen Methoden der USUV Vollgenomsequenzierung aus der zweiten (Illumina) und dritten Generation (MinION) verglichen. Die auf der Illumina-Plattform durchgeführte RNA-Sequenzierung erbrachte die umfangreichsten und fehlerärmsten Datensätze. Diese wurden mit zwei verschiedenen MinION-Methoden auf der Oxford Nanopore-Plattform verglichen, deren Hauptunterschied in einer Amplikon-basierten Voranreicherung des genetischen Materials lag. Die Ergebnisse zeigten, dass die spezifische Anreicherung zu einer deutlich besseren Datengenerierung führte. Für eine schnelle molekulare Analyse von USUV-Ausbrüchen in Deutschland, stellt daher die etablierte MinION-Amplikon-Sequenzierung zukünftig eine zuverlässige, preiswerte und sichere Methode der Wahl dar.

Diese Methode (MinION Amplikon) wurde in der folgenden Studie (Manuskript IV) anhand der Sequenzierung von 118 nachweislich USUV positiven Vögeln aus den Jahren 2017 bis 2021 validiert. Die Ergebnisse zeigten eine flächendeckende Verbreitung der USUV-Linien Afrika 3 und Europa 3 in Deutschland auf, während die USUV-Linie Europa 2 nur im östlichen Teil Deutschlands ko-zirkulierte. Mithilfe phylogenetischer Analysen wurde jeweils die geschätzte Zeit bis zum jüngsten gemeinsamen molekularen Vorfahren der drei Linien berechnet. Dabei ergab sich eine ein- bis dreijährige „Lücke“ zwischen dem berechneten ersten Auftreten einer jeden Linie und dem ersten molekularen Nachweis, was das gut funktionierende Wildvogelmonitoring in Deutschland unterstreicht. Außerdem konnten für zwei Cluster der USUV-Linie Afrika 3, die zeitlich weit auseinander liegen, gezeigt werden, dass eine evolutionäre Dynamik sehr wahrscheinlich ist. Weiterhin wurden bei drei Cluster der USUV-Linie Europa 3, die zeitlich eng begrenzt sind, auf mehrere, unabhängig erfolgte Einträge nach Deutschland geschlossen.

In der letzten Studie (Manuskript V) wurde die WNV-Impfung mit einem kommerziell erhältlichen inaktivierten Pferdeimpfstoff als Möglichkeit zum Schutz von wertvollen Zoovögeln in WNV-Endemie Gebieten in Form einer ersten Feldstudie erprobt. Durchgeführt wurde die Studie im Zoopark Erfurt in Thüringen, in dem es erstmals 2020 zu WNV bedingten Todesfällen in der Vogelpopulation kam. Abhängig vom Gewicht der Vögel wurde dreimalig im Abstand von drei Wochen ein Impfvolumen von 0,3 ml, 0,5 ml oder 1,0 ml intramuskulär appliziert, beziehungsweise ein angepasstes Impfprotokoll durchgeführt. Der Impfversuch verdeutlichte die Unschädlichkeit des verwendeten Impfstoffes in exotischen sowie einheimischen Vögeln und führte in den meisten Vögeln, die mit einer Impfdosis von 1,0 ml geimpft wurden, zu einer soliden Antikörperantwort. Die serologischen Untersuchungen lassen darauf schließen, dass nAk gegen USUV bzw. WNV aus vorangegangenen natürlichen Infektionen zu einer gesteigerten Immunantwort führen, in deren Konsequenz eine Ko-Protektion vermutet werden kann.

Die in dieser Arbeit dargelegten fünf Studien zeigten eindrücklich, dass Zoovögel gute Sentinel-Spezies für die Detektion von Flaviviren darstellen. Im Wildpark Schwarze Berge wurde die Zirkulation von USUV sowie der Nachweis von USUV nAk in Zoovögeln über vier Jahre erbracht, während im Jahr 2022 erstmalig Hinweise auf den Neueintrag von WNV detektiert wurden. Zudem konnte dargelegt werden, dass Pferde im westlichen Teil Deutschlands bislang noch nicht von WNV-Infektionen betroffen sind, während im östlichen Teil des Landes stetig mehr Tiere dem endemisch zirkulierenden Virus ausgesetzt sind. Außerdem konnte eine Amplikon-basierte Sequenzierungsmethode etabliert und an über 100 Feldproben validiert werden. Dies ermöglichte zum einen die geschätzte Zeit bis zum jüngsten gemeinsamen molekularen Vorfahren der detektieren USUV-Linien zu berechnen. Zum anderen kann mit dieser Methode zukünftig eine schnelle molekulare Überwachung in Ausbruchsgeschehen ermöglicht werden. Im Zoopark Erfurt wurde erstmals eine WNV-Impfstudie als Feldstudie zum Schutz von unterschiedlichen Zoovogelspezies durchgeführt. Diese Impfungen mit der inaktivierten Pferdevakzine wurde von den Tieren durchweg gut vertragen, was die Unschädlichkeit dieses Impfstoffes für verschiedene Vogelarten unterstreicht. Weiterhin führten die Impfungen in unterschiedlichen Intervallen zu guten Antikörperantworten, wodurch die geimpften Vögel vor einer WNV-Infektion in der darauffolgenden Saison wirksam geschützt wurden.

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