Mycosphaerella-Nadelpilze der Kiefer -Identifikation durch ITS-RFLP-Muster
Die Kiefernnadelpilze Mycosphaerella pini und M. dearnessii zählen weltweit zu den gefährlichsten Parasiten der Baumgattung Kiefer und sind in der EU als Quarantäneschadorganismen eingestuft. Eine sichere und schnelle Diagnose ist die Grundvoraussetzung zur Anwendung geltender Quarantänevorschriften, um die weitere Ausbreitung dieser Erreger zu verhindern. Die Identifizierung der beiden Schadpilze ist mit herkömmlichen, makro- und mikroskopischen Methoden schwierig und zeitintensiv. Daher wurde ein molekulares Verfahren (lTS-RFLP-AnaIyse) entwickelt, mit dem die Mycosphaerella-Ivneti anhand der Restriktionsfragmentmuster der amplifizierten ITS-Bereiche ihrer ribosomalen DNA identifiziert werden können. Als Ausgangsmaterial wurde zunächst Iyophilisiertes Pilzmyzel aus Flüssigkulturen der Pilze verwendet. Die daraus extrahierte DNA wurde mit rDNA-spezifischen Primern amplifiziert und mit fünf Restriktionsenzymen gespalten. Die nach elektrophoretischer Auftrennung der DNA-Fragmente erhaltenen ITS-RFLPMuster waren speziesspezifisch und ermöglichten eine Identifizierung der beiden Mycosphaerella-Arten und ihre differentialdiagnostische Abgrenzung von 10 weiteren auf Kiefernnadeln vorkommenden Pilzarten. Verschiedene Stämme jeweils einer Mycosphaerella-Art zeigten das gleiche ITS-RFLP-Muster, wodurch die Arterkennung erleichtert wird. Zur direkten Untersuchung infizierter Nadelsegmente wurde ein DNA-Mikroextraktionsverfahren entwickelt, das ausreichend DNA für die ITSRFLP- Analyse liefert. Damit ist die molekulare Identifizierung der beiden Quarantäneschadpilze in zwei Tagen durchführbar.
The pine needle fungi Mycosphaerella pini and M. dearnessii are among the most dangerous parasites of pines worldwide and are classified as quarantine pests in the EU. A safe and fast diagnostic procedure is precondition for application of quarantine control, in order to prevent further spread of these pests. Identification of the two parasitic fungi by means of conventional macroand microscopic methods is difficult and time-consuming, Therefore, a molecular technique (ITS-RFLP analysis) was developed which permits identification of the Mycosphaerella species by means of restriction fragment patterns of their amplified ITS sections of ribosomal DNA. Lyophilized fungal mycelium from liquid culture of the fungi was used as starting material. DNA extracted from this material was amplified using rDNAspecific primers and digested using five restriction enzymes. ITS-RFLP patterns obtained after electrophoretic separation of DNA fragments were species-specific and permitted identification of the two Mycosphaerella species and their differential diagnostic distinction from 10 other fungus species also occurring on pine needles. Different strains within each Mycosphaerella species gave identical ITS-RFLP patterns, which facilitates species identification. For direct examination of infected needle segments, a DNA micro extraction procedure was developed that provides sufficient DNA for ITS-RFLP analysis. In this way, molecular identification of the two quarantine pest fungi can be carried out in two days.
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