Genetic relatedness and antimicrobial susceptibility of porcine respiratory tract pathogens Streptococcus suis, Bordetella bronchiseptica and Pasteurella multocida

Niemann, Lisa

Streptococcus suis is a Gram-positive bacterium and a commensal colonizing the porcine respiratory tract. However, some serotypes have a higher virulence and can cause pneumonia, meningitis, septicaemia, arthritis, endocarditis, polyserositis or abortion in pigs. Bordetella bronchiseptica and Pasteurella multocida are Gram-negative bacteria that can cause bronchopneumonia or atrophic rhinitis. Bacterial infections of the porcine respiratory tract are commonly treated with antimicrobials. In this thesis, bronchoalveolar lavage fluid samples (BALFs) of weaners of four to ten weeks of age and originating from 30 farrow-to-finish farms were investigated for the aforementioned pathogens. Furthermore, the influence of antimicrobial treatment during respiratory tract infection on such pathogens within a one-year period was monitored. The genetic relatedness of selected S. suis, B. bronchiseptica and P. multocida isolates on farm level and between different farms was investigated by macrorestriction with subsequent pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). In addition, the antimicrobial susceptibility and resistance mechanisms of the pathogens were determined. However, a valid recommendation to the susceptibility of the pathogens to all examined antibiotics is sometimes difficult, since CLSI approved breakpoints are not available for all tested antimicrobial agents. This study revealed a great diversity of PFGE patterns among S. suis isolates. Single pigs can harbor S. suis isolates with completely different macrorestriction patterns, which also differ in their antimicrobial susceptibilities. B. bronchiseptica showed a greater homogeneity in their PFGE patterns and P. multocida displayed related and different PFGE patterns. One or two closely related B. bronchiseptica isolates with quite similar minimal inhibitory concentrations (MICs) existed over a one-year period within one farm. One or two P. multocida isolates with different PFGE patterns can exist on one farm at a certain time point, nevertheless most P. multocida isolates had similar MICs. Antimicrobial agents were prescribed 24 times for five to seven days in the farms of this project. Doxycycline was most frequently prescribed (n=14 times) in this study, followed by amoxicillin (n=8), amoxicillin/clavulanic acid (n=1) and tiamulin/florfenicol (n=1). S. suis isolates were frequently tetracycline-resistant, since they harbored resistance genes such as tet(O), tet(M), tet(L) or tet(W). S. suis exhibited higher MICs to tiamulin, was susceptible to florfenicol and to aminopenicillins alone and in combination with clavulanic acid. However, individual S. suis isolates showed distinctly higher MICs to penicillin. Therefore, three S. suis isolates, which were susceptible, intermediate or resistant to penicillin were subjected to whole genome sequencing. The analyses of the whole genome sequences revealed genes encoding five penicillin-binding proteins (PBPs) for all three isolates. The penicillin-resistant isolate had the most amino acid alterations in PBP2x, PBP2b and PBP2a, whereas the penicillin-intermediate isolate had the most amino acid substitutions only in PBP2x and PBP2b compared to the penicillin-susceptible isolate. However, none of the isolates exhibited amino acid alterations in the conserved motifs, which form the catalytic centre of the PBPs and interact with penicillin. Tetracyclines may have bacteriostatic effects on B. bronchiseptica, since these bacteria exhibit low doxycycline and tetracycline MIC90 values of 0.25 mg/L and 0.5 mg/L, respectively. The B. bronchiseptica isolates showed an overall reduced susceptibility to β-lactams except for amoxicillin/clavulanic acid. B. bronchiseptica isolates had a tiamulin MIC90 of ≥128 mg/L and were either susceptible or intermediate towards florfenicol. The P. multocida isolates were overall β-lactam- and florfenicol-susceptible. Some isolates showed tetracycline MICs of 1 mg/L (n=9) and 2 mg/L (n=3) that classified the respective isolates as intermediate and resistant, respectively. The tiamulin MIC90 was 32 mg/L. Regardless of the antimicrobial treatment on the farms, trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT)-resistant P. multocida isolates were detected on three different farrow-to-finish farms. A closer examination of these isolates revealed their close genetic relatedness and the existence of a dfrA14-carrying, 6 kb plasmid. The dfrA14 gene mediates trimethoprim resistance and was detected in P. multocida for the first time. However, a similar plasmid with a nucleotide sequence identity of 99.9 % to that of P. multocida was already identified in Actinobacillus pleuropneumoniae. Hence, we suspect that a plasmid exchange of the pathogens within the common habitat of the porcine respiratory tract has taken place in the past. The MIC testing revealed a broad susceptibility of S. suis and P. multocida to florfenicol as well as an intermediate susceptibility of B. bronchiseptica, which might identify florfenicol as an effective therapeutic alternative to tetracyclines or β-lactams. Besides, the frequent use of β-lactams, tetracyclines and sulfonamides in veterinary medicine increases the selection pressure on certain pathogens as shown in this thesis. Tetracycline resistance genes seems to become conserved in the streptococcal genome due to the frequent use of doxycycline. Former fully β-lactam susceptible isolates, such as S. suis, accumulate amino acid alterations in their PBPs, which mediate a lower affinity to penicillin. The development of a SXT resistance plasmid and its presence in already two members of the family Pasteurellaceae, demonstrates the dissemination of such plasmids within this family.

Streptococcus suis ist ein Gram-positives Bakterium und besiedelt den Respirationstrakt von Schweinen als Kommensale. Einige Serotypen haben jedoch eine höhere Virulenz, durch welche Pneumonien, Meningitis, Septikämien, Arthritis, Endokarditis, Polyserositis oder Abort bei Schweinen ausgelöst werden können. Bordetella bronchiseptica und Pasteurella multocida sind Gram-negative Bakterien, welche Bronchopneumonien oder Rhinitis atrophicans auslösen können. Bakterielle Infektionen des Respirationstrakts von Schweinen werden gewöhnlich mit Antibiotika behandelt. In dieser Arbeit wurden bronchoalveoläre Lavageflüssigkeiten (BALF) von vier bis zehn Wochen alten Absetzferkeln aus 30 Ferkelerzeugerbetrieben auf die vorab genannten Pathogene hin untersucht sowie die antimikrobielle Behandlung von Atemwegserkrankungen innerhalb eines Jahres erfasst. Die genetische Verwandtschaft ausgewählter S. suis, B. bronchiseptica und P. multocida Isolate wurde auf Betriebsebene sowie zwischen verschiedenen Betrieben mit Hilfe der Makrorestriktionsanalyse und anschließender Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) analysiert. Zusätzlich wurde die antimikrobielle Empfindlichkeit der Pathogene sowie deren Resistenzmechanismen untersucht. Die Bewertung der Empfindlichkeit einiger Pathogene gestaltete sich teilweise schwierig, da nicht für alle getesteten Antibiotika seitens CLSI anerkannte Grenzwerte vorhanden sind. Diese Studie zeigt eine große genetische Diversität zwischen den untersuchten S. suis Isolaten. Einzelne Schweine können S. suis Isolate mit unterschiedlichen Makrorestriktionsmustern und verschiedenen antimikrobiellen Empfindlichkeiten tragen. B. bronchiseptica zeigte eine größere genetische Homogenität hinsichtlich der Makrorestriktionsmuster, wohingegen P. multocida eine etwas breitere Verwandtschaft der Isolate aufweist. Pro Betrieb konnten in einem Zeitraum von einem Jahr ein oder zwei eng verwandte B. bronchiseptica Isolate mit ähnlichen minimalen Hemmstoffkonzentrationen (MHKs) nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu, konnten mitunter zwei P. multocida Isolate mit unterschiedlichen Makrorestriktionsmustern im gleichen Betrieb zu einem bestimmten Zeitpunkt existieren, welche jedoch ähnliche MHK Werte aufweisen. Die antimikrobielle Behandlung auf den Betrieben dauerte fünf bis sieben Tage. Insgesamt wurde auf den Farmen 24-mal ein Antibiotikum angewendet. Doxycyclin war mit 14 Anwendungen das am häufigsten verwendete Antibiotikum in dieser Studie, gefolgt von Amoxicillin (8 Anwendungen) sowie Amoxicillin/Clavulansäure und Tiamulin/Florfenicol (je eine Anwendung). S. suis Isolate waren meist resistent gegenüber Tetrazyklinen, da sie Resistenzgene wie z.B. tet(O), tet(M), tet(L) oder tet(W) trugen. S. suis zeigte erhöhte MHK Werte gegenüber Tiamulin, war jedoch empfindlich gegenüber Aminopenicillinen und deren Kombination mit Clavulansäure. Jedoch zeigten einige S. suis Isolate auch deutlich höhere Penicillin MHK-Werte. Aus diesem Grund wurden drei Isolate, welche empfindlich, intermediär und resistent gegenüber Penicillin waren, ausgewählt und einer Gesamtgenomsequenzierung unterzogen. Die Analyse der Gesamtgenomsequenzen ergab für die drei Isolate jeweils fünf Gene, die für Penicillin-bindende Proteine (PBPs) kodierten. Im Vergleich zu dem Penicillin-sensiblen Isolat wies das Penicillin-resistente Isolat die meisten Aminosäureänderungen in PBP2x, PBP2b und PBP2a auf, wohingegen das Penicillin-intermediäre Isolat die meisten Aminosäureänderungen in PBP2x und PBP2b aufwies. Keines der Isolate zeigte Aminosäureveränderungen in den konservierten Sequenzmotiven, welche das katalytische Zentrum der PBPs bilden und mit Penicillin interagieren. Die untersuchten B. bronchiseptica Isolate zeigten niedrige Doxycyclin und Tetrazyklin MHK90 Werte mit jeweils 0.25 mg/L und 0.5 mg/L, welche einen bakteriostatischen Effekt haben könnten. Die B. bronchiseptica Isolate besitzen eine umfassende β-Laktam Resistenz, ausgenommen gegen die Kombination von Amoxicillin/Clavulansäure. In dieser Studie hatten die B. bronchiseptica Isolate einen Tiamulin MHK90 von 128 mg/L und zeigten MHK-Werte, die sie als empfindlich oder intermediär gegenüber Florfenicol klassifizieren. P. multocida war empfindlich gegenüber β-Laktamen und Florfenicol. Einzelne P. multocida Isolate zeigten mit 1 mg/L (n=9) und 2 mg/L (n=3) Tetrazyklin MHK Werte, die sie als intermediär bzw. resistent klassifizieren. Der Tiamulin MHK90 der untersuchten Isolate lag bei 32 mg/L. Unabhängig von den Antibiotikabehandlungen in den Betrieben wurden Trimethoprim/Sulfamethoxazol (SXT)-resistente P. multocida Isolate in drei verschiedenen Ferkelerzeugerbetrieben detektiert. Eine genauere Untersuchung dieser Isolate ergab eine enge genetische Verwandtschaft zwischen diesen Isolaten und das Vorhandensein eines 6 kb großen Plasmides, welches die Gene sul2 und dfrA14 trug. Das dfrA14 Gen vermittelt Resistenz gegenüber Trimethoprim und wurde in dieser Studie zum ersten Mal bei P. multocida nachgewiesen. Ein ähnliches Plasmid mit einer Sequenzübereinstimmung von 99.9 % wurde bereits bei Actinobacillus pleuropneumoniae identifiziert. Man könnte daher einen Plasmidaustausch zwischen den beiden Bakterienspezies in ihrem gemeinsamen Habitat, dem Respirationstrakt des Schweins, in der Vergangenheit annehmen. Unsere Untersuchungen verdeutlichten, dass S. suis und P. multocida eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Florfenicol besitzen, während B. bronchiseptica auch intermediäre MHK Werte aufweist. Daher kann Florfenicol als eine wirkungsvolle Therapiealternative zu Tetrazyklinen und β-Laktamen angesehen werden. Außerdem führt der häufige Gebrauch von β-Laktamen, Tetrazyklinen und Sulfonamiden in der Veterinärmedizin zu einem erhöhten Selektionsdruck gegenüber einigen Pathogenen, wie in dieser Studie gezeigt wurde. Gene, welche Tetrazyklinresistenz vermitteln, scheinen durch den häufigen Therapieeinsatz von Doxycyclin bereits im Streptokokkengenom konserviert zu sein. Zudem weisen Isolate, wie z.B. S. suis, die zuvor vollständig empfindlich gegenüber Penicillin waren, eine Ansammlung von Aminosäureveränderungen in ihren PBPs auf. Diese Veränderungen können zu einer geringeren Affinität der Isolate gegenüber Penicillinen führen. Die Entstehung eines SXT- Resistenzgene-tragenden Plasmids sowie dessen bereits vorliegende Existenz in zwei Mitgliedern der Familie Pasteurellaceae verdeutlicht die mögliche weitere Verbreitung solcher Plasmide innerhalb dieser Familie sowie deren klinische Relevanz.

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Niemann, Lisa: Genetic relatedness and antimicrobial susceptibility of porcine respiratory tract pathogens Streptococcus suis, Bordetella bronchiseptica and Pasteurella multocida. Berlin 2019. Freie Universität Berlin.

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