Genetic relatedness and antimicrobial susceptibility of porcine respiratory tract pathogens Streptococcus suis, Bordetella bronchiseptica and Pasteurella multocida

Streptococcus suis ist ein Gram-positives Bakterium und besiedelt den Respirationstrakt von Schweinen als Kommensale. Einige Serotypen haben jedoch eine höhere Virulenz, durch welche Pneumonien, Meningitis, Septikämien, Arthritis, Endokarditis, Polyserositis oder Abort bei Schweinen ausgelöst werden können. Bordetella bronchiseptica und Pasteurella multocida sind Gram-negative Bakterien, welche Bronchopneumonien oder Rhinitis atrophicans auslösen können. Bakterielle Infektionen des Respirationstrakts von Schweinen werden gewöhnlich mit Antibiotika behandelt. In dieser Arbeit wurden bronchoalveoläre Lavageflüssigkeiten (BALF) von vier bis zehn Wochen alten Absetzferkeln aus 30 Ferkelerzeugerbetrieben auf die vorab genannten Pathogene hin untersucht sowie die antimikrobielle Behandlung von Atemwegserkrankungen innerhalb eines Jahres erfasst. Die genetische Verwandtschaft ausgewählter S. suis, B. bronchiseptica und P. multocida Isolate wurde auf Betriebsebene sowie zwischen verschiedenen Betrieben mit Hilfe der Makrorestriktionsanalyse und anschließender Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) analysiert. Zusätzlich wurde die antimikrobielle Empfindlichkeit der Pathogene sowie deren Resistenzmechanismen untersucht. Die Bewertung der Empfindlichkeit einiger Pathogene gestaltete sich teilweise schwierig, da nicht für alle getesteten Antibiotika seitens CLSI anerkannte Grenzwerte vorhanden sind. Diese Studie zeigt eine große genetische Diversität zwischen den untersuchten S. suis Isolaten. Einzelne Schweine können S. suis Isolate mit unterschiedlichen Makrorestriktionsmustern und verschiedenen antimikrobiellen Empfindlichkeiten tragen. B. bronchiseptica zeigte eine größere genetische Homogenität hinsichtlich der Makrorestriktionsmuster, wohingegen P. multocida eine etwas breitere Verwandtschaft der Isolate aufweist. Pro Betrieb konnten in einem Zeitraum von einem Jahr ein oder zwei eng verwandte B. bronchiseptica Isolate mit ähnlichen minimalen Hemmstoffkonzentrationen (MHKs) nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu, konnten mitunter zwei P. multocida Isolate mit unterschiedlichen Makrorestriktionsmustern im gleichen Betrieb zu einem bestimmten Zeitpunkt existieren, welche jedoch ähnliche MHK Werte aufweisen. Die antimikrobielle Behandlung auf den Betrieben dauerte fünf bis sieben Tage. Insgesamt wurde auf den Farmen 24-mal ein Antibiotikum angewendet. Doxycyclin war mit 14 Anwendungen das am häufigsten verwendete Antibiotikum in dieser Studie, gefolgt von Amoxicillin (8 Anwendungen) sowie Amoxicillin/Clavulansäure und Tiamulin/Florfenicol (je eine Anwendung). S. suis Isolate waren meist resistent gegenüber Tetrazyklinen, da sie Resistenzgene wie z.B. tet(O), tet(M), tet(L) oder tet(W) trugen. S. suis zeigte erhöhte MHK Werte gegenüber Tiamulin, war jedoch empfindlich gegenüber Aminopenicillinen und deren Kombination mit Clavulansäure. Jedoch zeigten einige S. suis Isolate auch deutlich höhere Penicillin MHK-Werte. Aus diesem Grund wurden drei Isolate, welche empfindlich, intermediär und resistent gegenüber Penicillin waren, ausgewählt und einer Gesamtgenomsequenzierung unterzogen. Die Analyse der Gesamtgenomsequenzen ergab für die drei Isolate jeweils fünf Gene, die für Penicillin-bindende Proteine (PBPs) kodierten. Im Vergleich zu dem Penicillin-sensiblen Isolat wies das Penicillin-resistente Isolat die meisten Aminosäureänderungen in PBP2x, PBP2b und PBP2a auf, wohingegen das Penicillin-intermediäre Isolat die meisten Aminosäureänderungen in PBP2x und PBP2b aufwies. Keines der Isolate zeigte Aminosäureveränderungen in den konservierten Sequenzmotiven, welche das katalytische Zentrum der PBPs bilden und mit Penicillin interagieren. Die untersuchten B. bronchiseptica Isolate zeigten niedrige Doxycyclin und Tetrazyklin MHK90 Werte mit jeweils 0.25 mg/L und 0.5 mg/L, welche einen bakteriostatischen Effekt haben könnten. Die B. bronchiseptica Isolate besitzen eine umfassende β-Laktam Resistenz, ausgenommen gegen die Kombination von Amoxicillin/Clavulansäure. In dieser Studie hatten die B. bronchiseptica Isolate einen Tiamulin MHK90 von 128 mg/L und zeigten MHK-Werte, die sie als empfindlich oder intermediär gegenüber Florfenicol klassifizieren. P. multocida war empfindlich gegenüber β-Laktamen und Florfenicol. Einzelne P. multocida Isolate zeigten mit 1 mg/L (n=9) und 2 mg/L (n=3) Tetrazyklin MHK Werte, die sie als intermediär bzw. resistent klassifizieren. Der Tiamulin MHK90 der untersuchten Isolate lag bei 32 mg/L. Unabhängig von den Antibiotikabehandlungen in den Betrieben wurden Trimethoprim/Sulfamethoxazol (SXT)-resistente P. multocida Isolate in drei verschiedenen Ferkelerzeugerbetrieben detektiert. Eine genauere Untersuchung dieser Isolate ergab eine enge genetische Verwandtschaft zwischen diesen Isolaten und das Vorhandensein eines 6 kb großen Plasmides, welches die Gene sul2 und dfrA14 trug. Das dfrA14 Gen vermittelt Resistenz gegenüber Trimethoprim und wurde in dieser Studie zum ersten Mal bei P. multocida nachgewiesen. Ein ähnliches Plasmid mit einer Sequenzübereinstimmung von 99.9 % wurde bereits bei Actinobacillus pleuropneumoniae identifiziert. Man könnte daher einen Plasmidaustausch zwischen den beiden Bakterienspezies in ihrem gemeinsamen Habitat, dem Respirationstrakt des Schweins, in der Vergangenheit annehmen. Unsere Untersuchungen verdeutlichten, dass S. suis und P. multocida eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Florfenicol besitzen, während B. bronchiseptica auch intermediäre MHK Werte aufweist. Daher kann Florfenicol als eine wirkungsvolle Therapiealternative zu Tetrazyklinen und β-Laktamen angesehen werden. Außerdem führt der häufige Gebrauch von β-Laktamen, Tetrazyklinen und Sulfonamiden in der Veterinärmedizin zu einem erhöhten Selektionsdruck gegenüber einigen Pathogenen, wie in dieser Studie gezeigt wurde. Gene, welche Tetrazyklinresistenz vermitteln, scheinen durch den häufigen Therapieeinsatz von Doxycyclin bereits im Streptokokkengenom konserviert zu sein. Zudem weisen Isolate, wie z.B. S. suis, die zuvor vollständig empfindlich gegenüber Penicillin waren, eine Ansammlung von Aminosäureveränderungen in ihren PBPs auf. Diese Veränderungen können zu einer geringeren Affinität der Isolate gegenüber Penicillinen führen. Die Entstehung eines SXT- Resistenzgene-tragenden Plasmids sowie dessen bereits vorliegende Existenz in zwei Mitgliedern der Familie Pasteurellaceae verdeutlicht die mögliche weitere Verbreitung solcher Plasmide innerhalb dieser Familie sowie deren klinische Relevanz.