Vergleich unterschiedlicher Rabiesviren hinsichtlich Infektion, intrazellulärer Lokalisation und zellulärer Faktoren in primären Neuronenkulturen

Christen, Michael

Als Grundlage für die Expressions- und Infektionsstudien dieser Arbeit wurden die Präparation, Langzeitkultivierung und Transfektion mittels Elektroporation von primären Neuronenkulturen aus Ratten etabliert. Obwohl mittels Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation versucht wurde, eine reine Neuronenkultur zu erzielen, konnten anhand spezifischer Zellmarker nicht-neuronale Astrozyten und Mikroglia nachgewiesen werden. Untersuchungen zu Proteinverteilungen zwischen laboradaptierten Rabiesviren und hochvirulenten Feld-Rabiesviren in primären Neuronen ergaben grundlegende Unterschiede in der Lokalisation der Glykoproteine. Während die Oberflächenexpression vom Glykoprotein bei laboradaptierten Viren erhöht war und es sowohl im Zellsoma als auch in den Neuriten nachgewiesen wurde, traten bei den Feldviren zytoplasmatische Akkumulationen auf, die in direkter Nähe der Phosphoprotein- und Nukleoprotein-Inclusion bodies lokalisiert waren. Diese Ergebnisse bekräftigten die vorab erstellte Hypothese, dass sich laboradaptierte Rabiesviren und Feldviren in ihrem intraneuronalen Transport des Glykoproteins unterscheiden. Während sich hochvirulente Feldviren strikt transsynaptisch von Neuron zu Neuron ausbreiten, könnten laboradaptierte Viren aufgrund eines deregulierten Glykoprotein-Oberflächentransports an der gesamten Neuronenoberfläche freigesetzt werden und wären somit in der Lage, auch nicht-neuronale Zellen wie z.B. Astrozyten zu infizieren und so möglicherweise eine lokale Immunantwort zu triggern. Unterschiede in der Fähigkeit zwischen laboradaptierten Viren und Feldviren, nicht-neuronale Zellen zu infizieren, konnten in Untersuchungen zum Zelltropismus nicht nachgewiesen werden. Durch Auszählung infizierter Zelltypen anhand von Zellmarkern konnte gezeigt werden, dass sich die Viren in den Primärzellkulturen in ihrem Tropismus nicht unterscheiden. Neben einer präferentiellen Infektion von Neuronen wurde beobachtet, dass jedes Virus in der Lage war, auch Astrozyten zu infizieren. Dagegen konnten keine Infektionen von Mikroglia beobachtet werden. Untersuchungen zu möglichen Kolokalisationen zwischen viralen Proteinen und dem präsynaptischen Vesikelprotein Synapsin 1 konnten aufgrund der Kreuzreaktivität eines Sekundärantikörpers nicht zuverlässig ausgewertet werden. In einem zweiten Teil wurde zur Etablierung einer dominant-negativen Inhibition ein Fusionsprotein aus einem motorlosen Kinesin der Familie 1 (Isoform KIF5C) und dem Reporterprotein mCherry generiert, welches für Untersuchungen des anterograden Transports von Rabiesviren verwendet werden sollte. Nach Expression in BSR T7/5-Zellen konnte eine diffuse, rote Fluoreszenz mit punktuellen Akkumulationen beobachtet werden. Eine Relokalisation von Mitochondrien, die über die Kinesinfamilie 1 transportiert werden, konnte nach Expression des motorlosen Kinesins nicht beobachtet werden. Da in Western Blot Analysen das vollständige Fusionsprotein nicht nachgewiesen werden konnte, wurde gefolgert, dass eine Mutation in der Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führte. Aus Zeitgründen wurde keine vollständige Sequenzierung des generierten Klons durchgeführt, sodass fraglich blieb, inwieweit dies zutraf.

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Christen, Michael: Vergleich unterschiedlicher Rabiesviren hinsichtlich Infektion, intrazellulärer Lokalisation und zellulärer Faktoren in primären Neuronenkulturen. Greifswald 2019. Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät.

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