Tenazität von hochpathogenen Erregern in Lebensmitteln und Schnellmethoden zu deren Nachweis am Beispiel Brucella

Zur Bewertung des Risikos im Fall einer absichtlichen Ausbringung von Brucellen in die Lebensmittelkette sind Kenntnisse zur Tenazität des Erregers in relevanten Lebensmittelmatrizes erforderlich. Daher wurde das Überleben von Brucella abortus 1119-3 in Rohmilch sowie in kommerziell erhältlichen Lebensmitteln wie H-Milch, Vorzugsmilch, Joghurt und stillem Mineralwasser bei handelsüblichen Lagerungstemperaturen untersucht. Besonders lange überlebten B. abortus 1119-3 und B. melitensis 16M in H-Milch, in der die Zellzahl anstieg und bis zum Ende des Versuchs nach 88 Tagen eine Konzentration von über 10^8 KbE/ml aufwies. In stillem Mineralwasser war B. abortus 1119-3 über einen Zeitraum von 60 Tagen kulturell nachweisbar, wobei die Zellzahl kontinuierlich abnahm. Bis zum Ende der Mindesthaltbarkeit des Produktes (jeweils vier Tage) überlebte der genannte Stamm in Vorzugsmilch und Rohmilch. In Joghurt konnten hingegen lebende Zellen nur zwei (1,5 % Fett), vier (3,5 % Fett) bzw. einen Tag (10 % Fett) nachgewiesen werden, wobei der schnelle Rückgang der Zellkonzentration wahrscheinlich durch den niedrigen pH-Wert von 4,2 verursacht wurde. Bei einer absichtlichen Kontamination würden Brucellen für zwei Wochen (stilles Mineralwasser) bzw. über Monate (H Milch) in einer hohen Konzentration in den Lebensmitteln überleben und beim Verzehr mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einer Brucellose führen.Für die Erkennung und Typisierung von Brucellen im Fall der absichtlichen Kontamination von Lebensmitteln müssen geeignete Schnellmethoden zur Verfügung stehen. Deshalb wurden sechs verschiedene Methoden in Kombination mit der PCR auf ihre Effizienz zur Extraktion und zum Nachweis von Brucella-DNA aus relevanten Lebensmittelmatrizes untersucht. Für stilles Mineralwasser und physiologische Kochsalzlösung erwies sich das QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) mit einer Nachweisgrenze von 5 x 10^1 KbE/ml am sensitivsten. Für Rohmilch eigneten sich sowohl der Kit von Qiagen als auch die Phenol-Chloroform-Extraktion, wobei letztere mit höherer Zuverlässigkeit bis zu 5 x 10^1 KbE/ml nachwies. Die Nachweisgrenze für Brucellen in Joghurt (10 % Fett) lag bei Anwendung der Phenol-Chloroform-Extraktion mit 1 x 10^2 KbE/ml niedriger als mit dem QIAamp DNA Mini Kit (1 x 10^4 KbE/ml). Mit der für Milchprodukte tauglichen Phenol-Chloroform-Extraktion wurden bis zu 5 x 10^2 KbE/g in Camembert und in Ziegenfrischkäse nachgewiesen. Die DNA-Extraktion aus Weichkäse erfordert eine Homogenisation nach Verdünnung mit Flüssigkeit und führt deshalb zu einer Abnahme der Sensitivität. Im Gegensatz zur mehrere Tage dauernden Kultivierung von Brucellen auf Nährmedien, für die ein Labor der Sicherheitsstufe 3 erforderlich ist, kann durch die Kombination aus DNA-Extraktion und Real-Time PCR ein Nachweis innerhalb eines halben (QIAamp DNA Mini Kit) bzw. innerhalb eines Arbeitstages (Phenol-Chloroform-Extraktion) in einem Labor der Sicherheitsstufe 2 erfolgen. Eine Erhöhung der Sensitivität zum Nachweis der Brucella-DNA war allerdings mittels Real-Time PCR im Vergleich zur herkömmlichen PCR nicht möglich.Mit dem Ziel, die Nachweisgrenzen für Brucella-DNA insbesondere in Milchprodukten zu optimieren, wurde die immunomagnetische Separation (IMS) als spezielle Methode für die Voranreicherung und Aufreinigung der DNA untersucht. Zu diesem Zweck wurden tosylaktivierte immunomagnetische Partikel eingesetzt, die mit einem Brucellose-Vollserum bzw. einem monoklonalen anti-Brucella-Antikörper beschichtet waren. Trotz Optimierung der IMS in Abhängigkeit verschiedener Parameter, wie Probenvolumen, Inkubationszeit und temperatur lag die Grenze zum Nachweis der Brucella-DNA bei 5 x 10^3 KbE/g für Ziegenfrischkäse, bei 1 x 10^3 KbE/ml für Rohmilch und stilles Mineralwasser, bei 8 x 10^4 KbE/ml für Joghurt und bei 5 x 10^4 KbE/g für Camembert und war deshalb weniger sensitiv als die vorgenannten Extraktionsmethoden.