Cellular factors modulating the entry efficiency of West Nile virus – Involvement of integrins

Das West-Nil-Virus (WNV) könnte unter den sich verändernden Umwelt- und Klimabe-dingungen und in Folge des zunehmenden weltweiten Reiseverkehrs und Handels eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheitsvorsorge darstellen. Das Virus wurde 1937 aus dem Blut einer fiebernden Frau in der West-Nil Region Ugandas isoliert, erhielt aber erst weltweite Aufmerksamkeit, nachdem es 1999 in die USA eingeschleppt worden war, und sich innerhalb von drei Jahren über den nordamerikanischen Kontinent verbreitet hatte. Seitdem werden in den USA jährlich mehrere hundert Menschen und Pferde mit WNV infiziert, – vielfach mit tödlichem Ausgang. In den letzten Jahren wurde eine zunehmende Anzahl von WNV-Ausbrüchen auch in Europa gemeldet. Um dieser Bedrohung mit Präventions-, Bekämpfungs- und Behandlungs-Strategien begegnen zu können, ist das Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Infektion von Wirtszellen von großer Bedeutung, weil diese wesentlich die Übertragung und Pathogenese von WNV, sowie die spezifische Empfänglichkeit verschiedener Wirtsspezies beeinflussen. Zu diesem Zweck ist die Identifizierung von Rezeptoren und von mit diesen assoziierten Molekülen unabdingbar, da sie den Eintritt von WNV in die Zelle vermitteln bzw. daran beteiligt sind. Die ersten Interaktionen mit der Wirtszelle bestimmen nicht nur die Empfänglichkeit der Zelle gegenüber dem Virus, sondern sie tragen möglicherweise auch zum außer-gewöhnlich breiten Wirtstropismus von WNV bei. Das Integrin αvb3 soll der älteren Literatur zufolge für WNV als zellulärer Rezeptor dienen; allerdings wurde kürzlich eine Beteiligung am Eintritt des Virus in die Zelle bezweifelt. Diese wissenschaftliche Kontroverse bildet die Grundlage für die vorliegende Studie. Ziel ist es zu klären, ob Integrine am Viruseintritt beteiligt sind. Dies schließt weitere Fragestellungen hinsichtlich ihrer Funktion, der relativen Bedeutung ihrer Beteiligung am Eintritt und mögliche Unterschiede in der Bindungs- und Endozytoseeffizienz von verschiedenen Virusstämmen ein. Um die Empfänglichkeit spezifisch Integrin-defizienter Zellen für WNV zu untersuchen, wurde ein Zell-kulturmodell etabliert, das auf Mausfibroblastenzellen beruht. Wildtyp, αv-Integrin-defiziente, β3-Integrin-defiziente und αvβ3-Integrin-Doppelknock-out Fibroblasten wurden aus 12,5 Tage alten Mausembryonen mit einer Modifikation der genomischen Sequenz der entsprechenden Integrin-Untereinheit isoliert. Die Zellen wurden in Kultur gebracht und hinsichtlich ihrer Expressionsmuster mit Immunfluoreszenzfärbung und bezüglich der Expressionshöhe mithilfe von Durchflusszytometrie charakterisiert. Außerdem wurden β1-Integrin-defiziente Mausnierenfibroblasten und ihre Mutterzelllinie in die Untersuchungen einbezogen. Die Wildtypzellen und Integrin-defizienten Zelllinien wurde in einem parallelen Ansatz mit jeweils einem der vier WNV-Stämme New York 1999, Dakar, Uganda und Sarafend infiziert. Um die Effizienz der Bindung und der Internalisierung anhand der Virusausbeute zu bestimmen, wurde mittels qRT-PCR die Anzahl der Viruspartikel gemessen. Außerdem wurde die Beteiligung von zellmembran-gebundenem Heparansulfat als Faktor für die Anheftung der Viren an die Zelloberfläche untersucht. Zu diesem Zweck wurden zwei Zelltypen, Lcells (Maus-Bindegewebszellen) und CHO-K1 Zellen (Ovarzellen des Chinesischen Hamsters), und ihre Glykosaminoglykan- oder Heparansulfat-defizienten Abkömmlinge infiziert, um die Bindungs- und Replikationseffizienzen vergleichen zu können. Die wesentlichen Schluss-folgerungen aus den Versuchen sind Folgende: (i) Das Vorhandensein von αv-, b1- oder b3-Integrinen auf der Oberfläche von Zellen ist keine Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion der Mausfibroblastenzellen mit WNV. Alle vier WNV-Stämme konnten sich in den Integrin-defizienten Zellen vermehren. Allerdings war die Replikationseffizienz in den β3-Integrin-defizienten Zellen deutlich geringer als in den Wildtypzellen. Aus diesem Grund wurden β3-Integrin-defiziente embryonale Mausfibroblasten mit einem Expressions-Plasmid transfiziert, das die β3-Integrin-Untereinheit enthielt (‚Rescuezellen’; in Unterpunkt ii und iii behandelt). (ii) Die ursprüngliche Annahme, dass Integrine als Rezeptoren fungieren, die sowohl die Virusbindung als auch Virusaufnahme in einem einzigen Schritt vermitteln, wird verworfen. Die Bindungseffizienz an die Zelloberfläche Integrin-defizienter Zellen war vergleichbar mit der von Integrin-exprimierenden Zellen. Antikörper, die die b1- oder b3-Integrin-Untereinheit blockieren, waren nicht in der Lage, die Virusbindung an β1- oder β3-Integrin-exprimierende Zellen zu beeinträchtigten, und hatten keine Auswirkung auf den Erfolg der Infektion. (iii) Die Expression von Integrinen wirkt sich positiv auf die Virusausbeute aus, wie sie im Vergleich von β3-Integrin-Rescuezellen und β1-Integrin-exprimierenden (flox) Zellen zu den entsprechenden Integrin-defizienten Zellen deutlich wurde. In welcher Phase sich Integrine in den Viruseintritt in die Zelle oder in nachfolgende Abläufe einschalten, ist bisher unklar. Aufgrund der Oberflächenlokalisation von Integrinen wird eine Funktion auf der Ebene der Virusinternalisierung nahe gelegt, entweder indem sie die Endozytose vermitteln oder indem sie mit anderen bisher nicht identifizierten Oberflächenrezeptoren in Form von Aktivierung oder Inhibierung interagieren, oder indem sie diese Proteine so verändern, dass eine verbesserten Zugänglichkeit für das Virus erreicht wird. (iv) Unterschiede zwischen den vier WNV-Stämmen, die in dieser Arbeit verwendet wurden, wirken sich nicht auf die funktionelle Beteiligung von β1- und β3- Integrinen während des Viruseintritts und/oder der Virusreplikation aus. (v) Die Wiederherstellung (Rescue) der β3-Integrin-Untereinheit in CHO-K1 Zellen und die konstitutive Expression von αvβ3-Integrinen in den stabil transfizierten Zellen führt nicht zur Permissivität für WNV. Deshalb wird angenommen, dass ein anderes Oberflächenprotein die Internalisierung ermöglicht, entweder im Zusammenwirken mit oder unabhängig von αvβ3-Integrinen. Außerdem unterscheidet sich die Effizienz der Bindung an die Zelloberflächen der CHO-K1-Zellen nicht wesentlich von der anderer Zellen. In Übereinstimmung mit anderen Ergebnissen dieser Arbeit (siehe Unterpunkt ii) deutet dies darauf hin, dass αvb3-Integrine weder die Bindung von WNV an die Zelloberfläche noch die Virusaufnahme in die Zelle in einem eigenständigen, von anderen Faktoren unabhängigen Prozess bewirken. (vi) Heparansulfat kommt als Faktor für die Anheftung von WNV an Zelloberflächen in Frage; allerdings kann nur ein begrenzter Anteil aller gebundenen Viruspartikel dadurch erklärt werden. Die Zusammenfassung dieser Ergebnisse weist deutlich auf eine Beteiligung von αvβ3-Integrinen am WNV-Eintritt in Wirtszellen hin. Andererseits zeigen die Ergebnisse, dass die hier untersuchten Integrine nicht die einzigen Rezeptoren für WNV sind, sondern dass weitere Zelloberflächenproteine am Eintritt beteiligt sind, wie dies in der Literatur für andere Flavivirus Spezies beschrieben wurde. Andere Rezeptoren und rezeptorabhängige Wege werden entweder (i) alternativ oder (ii) zusätzlich zu αvβ3-Integrinen für die Infektion von Zellen benutzt. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Ansatzpunkte für die weitere Forschung, wenn es darum geht, die z ellulären Faktoren zu identifizieren, die entscheidend für den Eintritt von WNV sind, womit auch zum besseren Verständnis der grundlegenden Mechanismen der Virusinfektion beigetragen wäre. Dieses Wissen würde zweifellos zu einem tieferen Verständnis der WNV-Pathogenese und der unterschiedlichen Empfänglichkeit von Wirtszellen beitragen. Damit würde es möglich, in der öffentlichen Gesundheitsvorsorge geeignete Gegenstrategien zu entwickeln, und durch die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente die Vorbeugung und Behandlung auf der Ebene individueller Erkrankungen bei Mensch und Tier zu verbessern.