Entwicklung eines multiplex realtime PCR-Protokolles zum Nachweis von Koi-Herpesvirus (KHV) und Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion bei experimentell infizierten Spiegelkarpfen ( Cyprinus carpio)

Die Koi-Herpesvirus (KHV)-Infektion hat seit den 1990er Jahren große Schäden in der Aquakultur von Nutzkarpfen und Koi verursacht. Der KHV-Nachweis konnte mit der Entwicklung konventioneller PCRs gegenüber der Virusisolierung mittels Zellkultur und des elektronenmikroskopischen Nachweises von Viruspartikeln entscheidend verbessert werden. GILAD et al. (2004) entwickelten den genomischen Nachweis von KHV in Form eines real-time PCR-assays weiter. In der vorliegenden Untersuchung wurde die real-time PCR von GILAD et al. (2004) erstmals als multiplex real-time PCR-Protokoll verwendet, mit dem spezifisch und sensitiv KHV-Genom simultan zu einer internen Kontroll-DNA nach HOFFMANN et al. (2006) bestimmt werden kann. Das Detektionslimit von GILAD et al. (2004) von 10 Kopien KHV-Genomäquivalenten konnte mit dem entwickelten multiplex real-time PCR-Protokoll bestätigt werden. Mit dem vorliegenden Protokoll wurden fluktuierend 1 Kopie und verlässlich 10 bis 1010 Kopien KHV-Genomäquivalente gemessen. Die Verwendung und Koamplifikation einer universell einsetzbaren internen Kontrolle, die während der DNA-Extraktion hinzugefügt wird, ermöglicht die Qualitätskontrolle von DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation. Mittels Koamplifizierung der internen Kontrolle wird die Sicherheit der diagnostischen Aussage erhöht, außerdem wird die schnelle und einfache absolute Quantifizierung der genomischen KHV-DNA in Probenmaterial überhaupt erst ermöglicht. Das multiplex real-time PCR-Protokoll stellte sich als vergleichbar sensitiv zu den Protokollen basierend auf BERCOVIER et al. (2005) (konventionelle PCR), BERGMANN et al. (2006) (nested PCR) und PIKARSKY et al. (2004) (konventionelle PCR) heraus. Die konventionellen PCRs nach GRAY et al. (2002) modifiziert nach YUASA et al. (2005) und zuletzt die PCRs nach GRAY et al. (2002) und GILAD et al. (2002) schnitten schlechter ab. Zusätzlich wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Pathogenese der KHV-Infektion mit dem Ziel der Verbesserung der Diagnostik durchgeführt. Im Infektionsversuch wurden dafür Spiegelkarpfen mit KHV infiziert und im Verlauf sowohl klinisch erkrankte als auch rekonvaleszente Tiere untersucht. Parallel zu adulten Karpfen wurden juvenile Spiegelkarpfen zum Vergleich der Empfänglichkeit von verschiedenen Altersklassen infiziert und mit den adulten Karpfen zusammen gehältert. Die Karpfen wurden bei der für KHV permissiven Temperatur von 23 °C gehältert und mit zwei verschiedenen Infektionsdosen im Bad infiziert. Bei den adulten Spiegelkarpfen wurde zu regelmäßigen Beprobungszeitpunkten eine Untersuchung von Niere, Kieme, Kiemenabstrich und peripheren Blutleukozyten (PBL) durchgeführt. Mit dem entwickelten quantitativen multiplex real-time PCR-Protokoll nach GILAD et al. (2004) und HOFFMANN et al. (2006) wurde die Höhe des spezifischen KHV-DNA-Gehalts einer Probe bestimmt. Dabei ließ sich abhängig von Infektionsdosis, Klinik und Mortalität unterschiedlich viel KHV-DNA in den Materialien und damit erstmals auch im Kiemenabstrich und den peripheren Blutleukozyten (PBL) nachweisen. Die höhere Infektionsdosis bewirkte eine stärkere Klinik und eine schnellere und höhere Mortalität, sie hatte jedoch nur bedingt Einfluss auf den quantitativen Nachweis der KHV-DNA. Das Alter der im Versuch infizierten Karpfen hatte entscheidenden Einfluss auf die Ausprägung der Mortalität, nur juvenile Karpfen verstarben. Es konnte somit eine altersabhängige Resistenz für KHV beobachtet werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass durch KHV verursachte Mortalität unabhängig vom Zeitpunkt nach der Infektion mit in einer sehr hohen Viruslast im Gewebe der juvenilen Karpfen einhergeht. Während der klinischen Phase der Infektion konnten die höchsten Konzentrationen an KHV-DNA der adulten Karpfen gemessen werden. Insgesamt nahm der DNA-Gehalt in allen Probenmaterialien und demnach auch im Karpfen über die Zeit hinweg ab. 6 und 8 Wochen nach der Infektion ist in den untersuchten Proben rekonvaleszenter Tiere nur noch ein sehr geringer KHV-DNA-Gehalt nachzuweisen, was für die Ausprägung einer latenten beziehungsweise persistenten Phase des Herpesvirus in diesen Karpfen spricht. Der Nachweis von KHV-DNA in aufgereinigten PBL spricht für die Möglichkeit der systemischen Verteilung des Virus durch diese Blutfraktion. Da es sich aber lediglich um den Nachweis von DNA handelt, könnte es sich aber auch nur um Teile des zerstörten Virus handeln, der von diesem Teil des Immunsystems bekämpft wurde. Der Nachweis von KHV-DNA im Kiemenschleim konkretisiert die Vermutung der Ausscheidung von infektiösem Virus durch die Kiemen und damit die kiemenvermittelte schnelle Weiterverbreitung des Virus im Wasser. Das Nierengewebe erscheint im Vergleich der untersuchten Materialien am verlässlichsten zum Nachweis von KHV, da es quantitativ am stärksten belastet war und einen sensitiven Nachweis von KHV-DNA aus den Proben erlaubte. Nachteilig stellt sich die ausschließlich letale Entnahme dar. Von den nicht-letal zu entnehmenden Proben konnte KHV-DNA in den PBL am verlässlichsten und sensitivsten nachgewiesen werden, wobei in dieser Probe fast immer nur verhältnismäßig geringe Mengen gemessen werden konnten. Ferner schlägt der hohe Aufwand der PBL-Probenentnahme und die PBL-Aufarbeitung negativ zu Buche. Das Kiemengewebe erwies sich für die Diagnostik als etwas weniger sensitiv als die PBL. Kiemengewebe kann jedoch leicht entnommen und verarbeitet werden. Bei den untersuchten Kiemen fielen außerdem im Vergleich zu den PBL mehr hoch belastete Proben auf. Der Kiemenabstrich stellt die am wenigsten invasive Methode zur nicht-letalen Probenentnahme dar. Im Kiemenschleim gelang zwar der Nachweis von KHV-DNA, aber dieses Material wies die geringste Sensitivität auf. Vereinzelt konnten hohe Mengen an KHV-DNA gefunden werden. In der überwiegenden Anzahl der Kiemenschleimproben wurde jedoch nur eine geringe Viruslast gefunden Einige Proben des Infektionsversuchs konnten vergleichend mittels Elektronenmikroskopie, der Virusreisolierung und anschließendem Immunfluoreszenztest der Blindpassagen untersucht werden. In den Passagen des inokulierten Organmaterials konnten weder cpE noch Immunfluoreszenz beobachtet werden. Anhand der vorliegenden Ergebnisse wurde KHV mittels quantitativer multiplex real-time PCR sensitiv, zuverlässig und spezifisch nachgewiesen.