Prävalidierungsstudie zur Prüfung der toxischen Wirkung von inhalativ wirksamen Stoffen (Gase)

Linsel, G.; Bauer, M.; Berger-Preiß, E.; Gräbsch, C.; Kock, H.; Liebsch, M.; Pirow, R.; Ritter, D.; Smirnova, L.; Knebel, J.

Ziel dieses Projektes war die Prävalidierung einer Methodik zur Prüfung der toxischen Wirkung von Gasen nach Direktexposition von Lungenzellen des Menschen an der Luft-Flüssigkeitsgrenzschicht (Air Liquid Interface). Unter Koordination des Fraunhofer Instituts für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM Hannover) waren als weitere Prüflabore an diesem Verbundprojekt das Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ Leipzig), das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR/ZEBET Berlin) und die Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin (BAuA Berlin) beteiligt.Vier Testgase (Stickstoffdioxid (NO2), Schwefeldioxid (SO2), Ozon, Formaldehyd) sowie synthetische Luft als Negativkontrolle wurden in die erste Studie einbezogen. Als biologisches Prüfsystem diente die Lungenzelllinie A549 humanen Ursprungs, die auf mikroporösen Membranträgern an der Luft-Flüssigkeitsgrenzschicht kultiviert und verschiedenen Gaskonzentrationen bzw. synthetischer Luft ausgesetzt wurde. Nach einstündiger Exposition wurden die zytotoxische Wirkung über eine Lebendzellzahl-Messung und die gentoxische Wirkung mittels Comet-Assay erfasst. Die Zytotoxizität zeigte für alle vier Modellgase klare Dosis-Wirkungsbeziehungen. Darüber hinaus gab es eine gute Wiederholbarkeit innerhalb der Labore sowie eine sehr gute Übereinstimmung in der Lage und Form der Dosis-Wirkungsbeziehungen zwischen den Laboren. Für die Entwicklung eines Prädiktionsmodells wurden die In-vitro-EC50-Werte mit In-vivo-LC50-Werten für Maus und Ratte aus der Literatur verglichen. Hierbei zeigte sich ein enger Zusammenhang zwischen den In-vitro- und In-vivo-Daten. Die Auswertung gentoxischer Parameter ergab für SO2 und Formaldehyd Dosis-Wirkungsbeziehungen in allen Laboren. Hierbei konnten indirekte Hinweise für die Induktionen von DNA-Strangbrüchen (SO2) und DNA-Protein-Vernetzungen (Formaldehyd) gefunden werden. Die logistische Regressionsanalyse lieferte keine Hinweise für einen dosisabhängigen Effekt von NO2 und Ozon auf die Gentoxizität. Schwache Hinweise für einen gentoxischen Effekt dieser beiden Gase ergaben sich aus einer multivariaten Varianzanalyse. Vor Eintritt in die formale Validierungsphase ist eine Erweiterung der Datenbasis in einer zweiten Prävalidierungsphase geplant.

The aim of the study was the prevalidation of an inhalation toxicity test for gases using human lung cells exposed on the air liquid interface (ALI). Four test laboratories participated in the study: Fraunhofer Institut für Toxikologie und Experimentelle Medizin (ITEM Hanover, (co-ordination)), Helmholtz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ Leipzig), Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR/ZEBET Berlin) and Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin (BAuA Berlin). Four gases, nitrogen dioxide (NO2), sulfur dioxide (SO2), formaldehyde, ozone as well as synthetic air for negative control were investigated. The human alveolar cell line A549, grown on microporous membranes was exposed on the air liquid interface to different concentrations of test gases and synthetic air. The test design comprised one hour gas exposure followed by direct determination of cytotoxicity (electrical current exclusion method, CASY, Innovatis) and genotoxicity (Comet assay). Analyses of dose-response relationships for cytotoxicity showed a good repeatability within and reproducibility between the laboratories for all four gases. Comparison of the derived EC50 values with published LC50 values for mice and rats revealed a tight quantitative relationship between in vitro cytotoxicity and in vivo lethality. Genotoxic endpoints demonstrated clear and reproducible dose-response relationships for SO2 and formaldehyde, indicating DNA strand-breaks (SO2) and DNAprotein crosslinks (formaldehyde). No such dose-dependent effects could be observed for NO2 and ozone by means of logistic regression analysis. The multivariate analysis of variance showed subtle hints for genotoxic effects of both gases. Before entering a formal validation stage, extended prevalidation will be necessary to establish a set of data sufficiently large to allow for optimization of the prediction model.

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Linsel, G. / Bauer, M. / Berger-Preiß, E. / et al: Prävalidierungsstudie zur Prüfung der toxischen Wirkung von inhalativ wirksamen Stoffen (Gase). Dortmund, Berlin, Dresden 2011. Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin (baua).

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