Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of a murine implantation model

Seidl, Julius

published

Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of a murine implantation model

English
German

Organoids represent a promising in vitro alternative to animal testing, due to their ability to resemble the properties of in vivo tissues. However, a deeper understanding of their morphology and 3D structure is necessary for their optimal utilization. This thesis measures and compares the influence of different tissue clearing methods and deconvolution protocols on the 3D imaging of organoids. The organoids used in this thesis are embryoids from the MIVI (Murine in vitro implantation) model established at the at the German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R). The two clearing protocols FruGly and CUBIC, as well as the existing method using ProLong™, were evaluated based on their effects on fluorescence signal intensity, morphological changes and protocol usability. FruGly demonstrated significant improvements in signal intensity and preserved morphology, while being inexpensive, fast and easy to use. ProLong™ offered excellent fluorescence signals but it is expensive and caused shrinkage of the samples. CUBIC is inexpensive as well, but the clearing resulted in reduced fluorescence signals and sample swelling. Two deconvolution protocols were also compared, with ZEN software deconvolution resulting in higher resolution but limited control over used algorithms and instances, leading to concerns about controllability of the results. FIJI/ImageJ deconvolution, allowed more control but produced less improvement in resolution for the images. The results of this bachelor thesis suggest FruGly as the most suitable clearing protocol for the MIVI project, but further validation is required. The thesis demonstrates the impact of optimization and standardization of 3D imaging methods to improve the characterization and comparison of organoids.

Organoide stellen eine vielversprechende in vitro Alternative zu Tierversuchen dar, da sie die Eigenschaften von in vivo Gewebe nachahmen können. Allerdings ist ein tieferes Verständnis ihrer Morphologie und 3D Struktur notwendig, um sie bestmöglich zu nutzen. Diese Arbeit misst und vergleicht die Einflüsse von unterschiedlichen „Tissue Clearing“ Methoden und Deconvolution Protokollen auf die 3D Bildgebung von Organoiden. Die Organoide, mit welchen in dieser Arbeit gearbeitet wurde, sind Embryoide des MIVI (Murine in vitro Implantation) Modells, welches am Deutschen Zentrum zum Schutz von Versuchstieren (Bf3R) etabliert wurde. Die beiden „Clearing“Protokolle FruGly und CUBIC sowie das bestehende Protokoll, welches ProLong™ nutzt, wurden Aufgrund ihres Effekts auf die Fluoreszenzsignalintensitäten, morphologische Veränderungen und Anwendbarkeit der Protokolle bewertet. FruGly zeigte eine bedeutende Verbesserung bei den Signalintensitäten und beeinflusste die Größe der Embryoiden nicht, während es preiswert, schnell und einfach zu nutzen war. ProLong™ bot exzellente Fluoreszenzsignale, aber es ist kostenintensiv und verursachte das Schrumpfen der Proben. CUBIC ist ebenfalls preiswert, aber der „Clearing“ Prozess resultierte in reduzierten Fluoreszenzsignalen sowie dem Anschwellen der Proben. DeconvolutionProtokolle wurden ebenfalls verglichen, wobei die ZEN Software Deconvolution im Vergleich zur FIJI/ImageJ-Deconvolution zu einer erhöhten Auflösung führte. Im Gegensatz dazu überzeugte das FIJI/ImageJ-Programm mit einer besseren Einsicht und Kontrollierbarkeit der benutzten Algorithmen und Instanzen. Die Ergebnisse dieser Bachelorarbeit legen den Schluss nahe, dass FruGly das am besten geeignete „Clearing“-Protokoll für das MIVI-Projekt ist, aber auch, dass weitere Nachweise benötigt werden. Die Arbeit demonstriert den Einfluss von Optimierung und Standardisierung auf 3D bildgebende Methoden, um die Charakterisierung und den Vergleich von Organoiden zu verbessern.