Circadian regulation of the AhR signaling pathway
Common in vitro cell culture systems are widely used to understand physiological processes and disease development. However, these have a number of limitations such as the lack of the physiological 3D tissue architecture but also regulatory mechanisms, such as the circadian rhythm. For that reason, in vitro methods need to be improved to mimic as closely as possible the in vivo situation found in humans, and the regulatory framework of toxicological relevant pathways should be studied to better understand physiological processes. Even if the circadian rhythm has been linked to various important physiological processes, the molecular mechanism of these circadian regulations remains unravelled. The circadian rhythm is characterized by internal oscillations of physiological processes with a recurring periodicity of approximately 24 h and its synchronization depends mainly on the light-dark periods of the day. On the molecular level, the circadian rhythm is driven by the recurring expression of CLOCK genes, which regulate up to 48% of all human genes and ensures the proper daytime-depended activity. The uniform circadian rhythm of all cells in a tissue is often lost in common 2D in vitro cell culture systems but can be easily restored through artificial synchronization of these cells. Subsequently, such synchronized cell culture systems lead to enhanced quantitative and qualitative cellular response with a higher human relevance. A highly toxicological relevant pathway, which might be under circadian control is the AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) signaling pathway. In particular, in synchronized human breast cells the cellular response upon AhR-ligand binding shows a circadian pattern indicating a circadian regulation of the AhR pathway. This study describes for the first time important aspects of the mechanism behind the circadian regulation of the AhR signaling pathway. The circadian expression of AhR target genes, e.g. CYP1A1, is caused by a circadian activation of the CYP1A1 promoter but not a circadian expression of AhR itself. Upon ligand exposure, e.g. TCDD (2,3,7,8-Tetrachlordibenzodioxin), AhR translocates into the nucleus and binds not only with ARNT but also with the circadian rhythm regulator BMAL1. These interactions seem to be circadian phase-dependent, indicating a possible competition in AhR binding. Additionally, the AhR co-factor, p23, negatively modulated the circadian regulation of the AhR signaling and SP1 was identified as a novel AhR co-factor exhibiting a circadian protein expression, which possibly sustains the proper circadian regulation of the AhR pathway. Besides that, preliminary data suggest that GSK3β could be involved in the circadian regulation of the AhR pathway. Summarizing, all the findings of this thesis propose a possible mechanism for the circadian regulation of the AhR pathway and this work contributes to a better understanding of the circadian regulation of an important toxicological pathway, that might lead to the development of improved cell culture-based in vitro systems for toxicological and risk assessment strategies as well as for drug development with a higher human relevance.
Um physiologische Prozesse und die Entstehung von Krankheiten zu verstehen, werden häufig konventionelle in vitro Zellkultursysteme verwenden. Diese haben jedoch entscheidende Nachteile, denn sie weisen keine physiologische 3D-Gewebestruktur auf und zum anderen sind in diese Systeme keine Regulationsmechanismen wie der circadiane Rhythmus hinreichend abgebildet. Es ist von entscheidender Bedeutung, solche in vitro Methoden zu verbessern und neu zu entwickeln, um ein möglichst realistisches Abbild der physiologischen Eigenschaften des Menschen widerzuspiegeln. Darüber hinaus würde in der toxikologisch-biomedizinischen Forschung ein vertieftes molekulares Verständnis von relevanten Signalwege und Regulatoren zur Optimierung von vorhandene in vitro Systemen beitragen und die Aufklärung physiologischer Prozesse vorantreiben. Einer von diesen zentralen Regulatoren ist der circadiane Rhythmus. Obwohl dieser mit verschiedenen wichtigen physiologischen Prozessen verknüpft ist, wie z.B. mit dem Fremdstoffmetabolismus, bleiben molekulare Mechanismen der circadianen Regulation des Fremdstoffmetabolismus weiterhin ungeklärt. Der circadiane Rhythmus wird als biologische Oszillation mit einer wiederkehrenden Periodizität von 24 Stunden definiert, welche durch den Tag-Nacht Rhythmus vorgegeben wird. Auf zelluläre Ebene wird der circadiane Rhythmus durch eine oszillierende Expression von CLOCK-Genen angetrieben. Diese können bis zu 48% aller menschlichen Gene regulieren und determinieren so die tageszeitliche Aktivität von Geweben und Organen. In konventionellen 2D in vitro Zellkultursystemen folgt jede Zelle ihrem eigenen circadian Rhythmus, wodurch die tagesabhängige Synchronität eines Gewebes in einem Organismus nicht abgebildet wird. Diese Synchronität kann aber wiederhergestellt werden, indem die rhythmische Expression der CLOCK-Gene artifiziell stimuliert wird. In der Folge führen solche synchronisierten Zellkultursysteme zu einer verbesserten quantitativen und qualitativen zellulären Reaktion mit einer höheren humanen Relevanz. Der toxikologisch relevante AhR-Signalweg (Aryl hydrocarbon Receptor) scheint einer von den Prozessen im Fremdstoffmetabolismus zu sein, der eine circadiane Regulation aufweist. So zeigt die Zellantwort von synchronisierten humane Brustzellen nach Exposition mit AhR Liganden einen circadianen Rhythmus. Mit dieser Arbeit konnten nun erstmals wertvolle Erkenntnisse hinsichtlich des Mechanismus der circadianen Regulation des AhRSignalwegs gewonnen werden. So konnte gezeigt werden, dass die circadiane Expression von AhR-Zielgenen, wie z.B. CYP1A1, nicht auf einer circadianen Expression des Rezeptors zurückzuführen ist, sondern auf eine circadiane Aktivierung des XRE Promotors. Dabei wird der AhR nach Exposition mit dem Ligand TCDD in den Zellkern transportiert. Dort bindet er nicht nur mit ARNT, um die Expression seiner Zielgenen zu initiieren, sondern auch mit dem circadianen Regulator, BMAL1. Möglicherweise führt das zu einer kompetitiven Bindung zwischen AhR, ARNT und BMAL1, und somit zu einer circadianen regulierten Interaktion. Zusätzlich wurde gezeigt, dass der AhR Co-faktor, p23, die circadiane Regulation vom AhR-Signalweg negativ beeinflusst und SP1 wurde als ein AhR Co-faktor
identifizieret, der die circadiane Promotoraktivität positiv reguliert.
Interessanterweise konnte für SP1 auch eine circadian Proteinexpression nachgewiesen werden, die möglicherweise die physiologische, circadiane AhR-Regulation aufrecht hält. Präliminäre Daten deuten auf eine GSK3β-Abhängigkeit der circadianen Regulation des AhR-Signalwegs hinaus. Zusammenfassend ermöglichen die Ergebnisse dieser Studie die Ableitung eines potenziellen Mechanismus für die circadiane Regulation des AhRSignalwegs und tragen somit zu einem besseren Verständnis der circadianen Regulation eines bedeutenden toxikologischen Signalwegs bei. Dadurch können zukünftig verbesserter zellkulturbasierte in vitro Systeme entwickelt werden, die für toxikologische und biomedizinischen Forschung aber auch für Risikobewertungsstrategien von hoher Wichtigkeit sind.
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