Mass spectrometric characterisation of the interactomes of closely related zoonotic viruses differing in pathogenicity

Neu auftretende virale Zoonosen stellen eine ständige Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier dar. Die Kenntnis von Wirtsfaktoren, die die virale Pathogenität beeinflussen können, stellt somit eine höchst willkommene Grundlage für die Entwicklung von Behandlungs- oder Impfstoffstrategien dar. Um pathogenitätsbestimmende Wirtsfaktoren von drei hoch pathogenen (’high consequence’) zoonotischen Viren zu identifizieren, wurden die Interaktome von ausgewählten viralen Proteinen parallel zu den Interaktomen homologer Proteine von eng verwandten, jedoch nur schwach oder nicht pathogenen Viren analysiert. Zu diesem Zweck wurden Virusproteine zur Affinitätsanreicherung interagierender Wirtsproteine verwendet und diese massenspektrometrisch untersucht, um Listen von Proteinkandidaten zu erstellen, die den Pathotyp beeinflussen können. Diese bedürfen allerdings Folgeuntersuchungen zur Validierung und Bestimmung ihrer biologischen Funktion im Zusammenhang mit den viralen Lebenszyklen. Hierfür wurden die Interaktome von folgenden homologen Proteinen untersucht. Für die Filoviren der Transkriptionsfaktor VP30, der Kotranskriptionsfaktor VP35 und das Matrixprotein VP40 des nicht-pathogenen Reston Viruses (RESTV, Spezies Reston ebolavirus), des pathogenen Ebola Viruses (EBOV, Spezies Zaire ebolavirus) und zusätzlich des Lloviu Viruses (LLOV, Spezies Lloviu cuevavirus). Für die Arenaviren wurden das Nukleoprotein (NP), das Matrixprotein (Z) und das Glykoprotein (GP) des pathogenen Junín Viruses (JUNV, Spezies Argentine mammarenavirus) und des nicht-pathogenen Tacaribe Viruses (TCRV, Spezies Tacaribe mammarenavirus) ausgewählt und für die Henipaviren das Fusionsprotein F des apathogenen Cedar Viruses (CedV, Spezies Cedar henipavirus) und des pathogenen Nipah Viruses (NiV, Spezies Nipah henipavirus). Das experimentelle Vorgehen war, die mit einem Marker versehenen Virusproteine mittels Transfektion in menschlichen Zellen zu exprimieren und in einem zweiten Schritt die Interaktome nach Affinitätsanreicherung massenspektrometrisch zu analysieren. Die Quantifizierung von identifizierten Proteinen erfolgte mittels stabiler Isotopenmarkierung oder durch eine markierungsfreie Quantifizierung. Zur Beurteilung der Qualität der Proteininteraktionen wurde für den markierungsfreien Ansatz der Mass Spectrometry interaction STatistics (MiST) Algorithmus implementiert. Anhand der qualitativen und quantitativen Daten wurde eine begrenzte Anzahl von vielversprechenden Kandidaten für Folgeuntersuchungen ermittelt. Darüber hinaus wurden die Interaktome mit bioinformatischen Methoden wie Anreicherungsanalysen von Genannotationen und Netzwerkanalysen untersucht, um durch die Interaktionen beeinflusste zelluläre Signal- oder Stoffwechselwege zu identifizieren. Die Ubiquitin-Carboxyl-terminale Hydrolase 7 (USP7, auch bekannt als HAUSP) wurde als ein neuer spezifischer Interaktor des EBOV VP30 identifiziert und die Interaktion biochemisch charakterisiert. Dabei wurde die Interaktion auch in der Gegenrichtung bestätigt und deren Dissoziationskonstante (Kd-Wert) mittels Mikrothermophorese (MST) bestimmt. Der Kd-Wert der Interaktion von EBOV VP30 mit USP7 erwies sich als niedriger als der von USP7 mit RESTV VP30. Diese Arbeit gibt neue Einblicke in die Interaktome von Virusproteinen, einschließlich der oft vernachlässigten Virusarten mit geringer oder fehlender Pathogenität. Zudem reflektieren die Interaktome zu einem gewissen Grad die Pathogenität der Viren und bilden somit eine geeignete Grundlage für die Suche nach wirtseigenen Interaktionspartnern, die die Pathogenität des Virus mit bestimmen könnten.

Emerging zoonotic viruses are a constant threat to human and animal health. Therefore, knowledge about the host factors influencing viral pathogenicity is highly welcome as a basis for developing treatment or vaccine strategies. In order to identify host factors that potentially determine the pathogenicity of three highly pathogenic (’high consequence’) zoonotic viruses, the interactomes of selected viral proteins were analysed in parallel with the interactomes of the homologous proteins from closely related viruses which lack high pathogenicity. For this purpose, affinity purification mass spectrometry (AP-MS) was performed with the virus proteins as baits and lists of candidate proteins were generated that may determine the pathotype and warrant follow-up studies to characterise their function concerning the viral life cycles. In detail, the interactomes of virus pairs from the arenaviruses, filoviruses and henipaviruses were studied. The following protein homologues were selected: for filoviruses, the transcription factor VP30, the co-transcription factor VP35 and matrix protein VP40 of the non-pathogenic Reston virus (RESTV, species Reston ebolavirus), the pathogenic Ebola virus (EBOV, species Zaire ebolavirus), and, in addition, the Lloviu virus (LLOV, species Lloviu cuevavirus); in case of the arenaviruses the nucleoprotein (NP), matrix protein (Z) and glycoprotein (GP) of the pathogenic Junín virus (JUNV, species Argentine mammarenavirus) and the non-pathogenic Tacaribe virus (TCRV, species Tacaribe mammarenavirus); and for the henipaviruses, the fusion protein F of the apathogenic Cedar virus (CedV, species Cedar henipavirus) and the pathogenic Nipah virus (NiV, species Nipah henipavirus). The experimental approach was to express the tagged bait proteins in human cells by transfection with appropriate constructs, purify the interactomes by affinity enrichment and analyse their protein content by MS. Quantitation was performed by labelling with stable isotopes or by label-free quantification (LFQ). High-confidence interactions for the LFQ approach were identified using the Mass Spectrometry interaction STatistics (MiST) scoring tool. Qualitative and quantitative data were used to identify a limited number of candidates for follow-up research. Additionally, the interactomes were analysed with bioinformatical tools like term enrichment analysis and network analysis to identify cellular pathways which are possibly impacted by the expression of viral proteins. A novel specific interactor of EBOV VP30 was identified, ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase7 (USP7, also known as HAUSP), and the interaction was partially characterised. The interaction was confirmed by reverse-pull-down experiments, and the Kd value (determined by Microscale Thermophoresis, MST) was found to be lower than for the interaction of USP7 with the RESTV VP30. This work adds insight into virus protein interactomes, especially for the often neglected low pathogenic virus species. Furthermore, the pathogenicity of the viruses was refl ected to some degree in the interactomes of their proteins. The generated interactome data for the different virus species create a basis in the search for interactions that determine pathogenicity.

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