Simple and reliable diagnostics of viral pathogens

Ongoing globalization in the trade of goods and animals, increased human mobility, global warming, and the ever-increasing exploitation of formerly remote areas are leading to an increase in animal pathogens that can spread across continents in a very short time. This underscores the need for the development of methods that allow safe sample collection and transport while providing a broad range of diagnostic methods for rapid and standardized detection of viral pathogens with high diagnostic specificity and sensitivity. This cumulative thesis focuses on effective disease control, considering various aspects from sample collection and transport to sample processing, testing and test evaluation. To possibly simplify sample collection and transport, the suitability of various biosample collection cards was tested. Their inactivating and stabilizing efficacy on different viruses and the impact on downstream diagnostic procedures were investigated. Depending on the virus, almost all cards and filters showed complete inactivation within a few days. Based on these samples, various diagnostic methods such as real-time (RT)-PCR, sequencing or transfection can subsequently be performed. Despite the fact that complete inactivation was not observed for all viruses, the cards are still suitable for sampling and shipping, especially in remote regions where refrigeration is not possible, as the overall risk of transmission is low. Furthermore, the infectivity of single-stranded positive-sense viral RNA was investigated to assess the risk of transmission by an inactivated sample of a virus from this group. In a first animal experiment in cattle, it was shown that the full-length genome by itself can initiate a productive infection if it is injected into the lingual epithelium. In a second experiment, the naked RNA was applied by nebulization into the nose and by dropping onto the tongue, without epithelial injury. This did not lead to infection. Inactivated samples of viruses with such a genome orientation must therefore in principle be regarded as infectious, but the risk of transmission associated with these samples can be considered low. Finally, the proficiency of German state veterinary laboratories was evaluated with regard to FMD diagnostics. This involved the analysis of 24 samples for FMDV-specific nucleic acid by real-time RT-PCR and 16 samples for antibodies against nonstructural proteins of FMDV by ELISA. All participants demonstrated adequate proficiency, even though the virological detection of weakly positive samples caused sporadic problems for some laboratories. However, in an FMD-free country, this does not pose a threat to effective disease control. The purpose of this work is to contribute to simpler yet safer animal disease diagnostics. This is especially important in remote areas, where lack of refrigeration is often the limiting factor for successful sample submission. The quality of animal disease diagnostics in general is high but it faces new challenges due to climate change and increasingly intensive contact with wildlife. In this context, research into new methods for sampling and transport, assessment of risk associated with inactivated samples of single-stranded positive-sense RNA viruses and quality assurance of decentralized diagnostics represent an important contribution. In the long run, however, it is even more important to address the underlying causes. In the spirit of One Health, increased efforts must be made to rein in climate change and the inexorable spread of humans into previously untouched regions. Perhaps it will even be possible to push back Earth Overshoot Day towards the end of the year again.

Die stetige Globalisierung im Handel von Waren und Tieren, der immer einfacher werdende Tourismus auch über lange Strecken, die Klimaerwärmung und die stetige Neuerschließung von entlegenen Gegenden führt zu einem Mehraufkommen von Tierseuchenerregern, welche sich innerhalb kürzester Zeit Kontinente übergreifend ausbreiten können. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Entwicklung von Methoden, die eine sichere Probenentnahme sowie einen sicheren Probentransport ermöglichen und gleichzeitig eine breite Palette von Diagnosemethoden für den schnellen und standardisierten Nachweis viraler Erreger mit hoher diagnostischer Spezifität und Sensitivität bieten. Diese kumulative Doktorarbeit beschäftigt sich mit der effektiven Tierseuchenkontrolle, indem von der Probennahme über den Probentransport bis hin zur Probenverarbeitung, Testung und Auswertung verschiedene Aspekte betrachtet werden. Als mögliche Erleichterung in Bezug auf Probennahme und Transport wurde in einer ersten Studie die Tauglichkeit von sog. Biosample Collection Cards getestet. Untersucht wurden deren inaktivierende und stabilisierende Wirkung auf verschiedene Viren, sowie die anschließend noch durchführbaren diagnostischen Verfahren. Virusabhängig erfolgte bei fast allen Karten und Viren eine vollständige Inaktivierung innerhalb weniger Tage. Auf Basis dieser Proben waren anschließend eine Vielzahl an diagnostischen Methoden wie real-time (RT)-PCR, Sequenzierung oder Transfektion möglich. Trotz der nicht bei allen Viren vollständigen Inaktivierung eignen sich die Karten dennoch vor allem in entlegenen Gebieten sehr gut zur Probennahme und -versendung, da eine Kühlung nicht erforderlich ist und das Risiko einer Seuchenverschleppung durch die Karten insgesamt als gering eingestuft wird. Des Weiteren wurde die Infektiosität von einzelsträngiger viraler RNA positiver Polarität untersucht. Hierbei sollte eine Aussage darüber getroffen werden, inwieweit ein Übertragungsrisiko von inaktivierten diagnostischen Proben dieser Virusgruppe ausgeht. In einem Tierversuch konnte im Rind gezeigt werden, dass das „nackte“ virale Genom alleine in der Lage ist, bei Injektion in die Zunge eine produktive Infektion auszulösen. In einem zweiten Experiment, in dem die RNA lediglich in die Nase gesprüht bzw. auf die unverletzte Zunge aufgetropft wurde, kam es nicht zu einer Infektion. Inaktivierte diagnostische Proben von Viren dieser Gruppe müssen also prinzipiell als infektiös angesehen werden. Das Risiko einer Seuchenverschleppung durch die inaktivierten Proben kann aber als gering angesehen werden. Weiterhin wurde die diagnostische Kapazität der veterinärmedizinischen Untersuchungseinrichtungen der Bundesländer hinsichtlich der Diagnostik des Maul- und Klauenseuche-Virus (MKSV) überprüft. Dazu sollten die teilnehmenden Labore 24 Proben mittels real-time RT-PCR auf MKSV-spezifische Nukleinsäure untersuchen, sowie 16 Proben mittels ELISA auf Antikörper gegen Nichtstrukturproteine von MKSV. Dies gelang allen Teilnehmenden, wobei der virologische Nachweis von niedriglastigen Proben einigen Laboren Probleme bereitete. In einem MKS-freien Land stellt dies aber keine für die Tierseuchenbekämpfung relevante Einschränkung dar.

Durch diese Arbeit soll ein Beitrag zur einfacheren und dennoch sicheren Tierseuchendiagnostik geleistet werden. Vor allem in abgelegenen Gebieten ist dies von großer Bedeutung, da dort die fehlende Kühlkette oft der limitierende Faktor für eine erfolgreiche Probensammlung ist. Die Diagnostik von Tierseuchenerregern befindet sich insgesamt auf einem hohen qualitativen Niveau, sieht sich aber durch den Klimawandel und dem immer intensiver werdenden Kontakt mit Wildtieren vor neue Herausforderungen gestellt. In diesem Zusammenhang stellt die Bewertung neuer Methoden zur Probennahme und -transport, die Risikobewertung von inaktivierten diagnostischen Proben von Viren mit einzelsträngigen RNA-Genomen positiver Polarität, sowie die Qualitätssicherung bei der dezentralen Diagnostik einen wichtigen Betrag dar. Langfristig noch bedeutender ist allerdings das Bestreben, intensiver an den auslösenden Faktoren zu arbeiten. Im Sinne von „One Health“ sollte ganz allgemein versucht werden, den Klimawandel und die fortschreitende Ausbreitung des Menschen in bisher unangetastete Regionen zumindest zu verlangsamen und somit den „Earth Overshoot Day“ vielleicht sogar wieder etwas in Richtung Jahresende zu verlagern.

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