An experimental approach of an in vivo pathogen genome targeting strategy to generate African swine fever resistant pigs
The domesticated pig is invaluable as a global protein source. However, pork production frequently faces animal welfare and production challenges induced by viral disease outbreaks. For instance, the African swine fever virus (ASFV) reached eastern Europe in 2014 and in 2020 Germany. The virus causes mortalities of nearly 100 % in domestic pigs and wild boars. Until now, no treatments or vaccines are available, and containment of the virus relies on strict biosecurity measures. Therefore, it is of great importance to understand host-virus interactions to support the development of vaccines and/or anti-viral drugs. Genome editing tools such as CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and its associated protein) have made it possible to further understand host-pathogen interactions by altering the genome of the host or the pathogen to study the mechanisms of infections. The CRISPR-Cas9 system is comprised of two main components; the Cas9 endonuclease which induces DSBs (double-strand breaks) in DNA and a guide RNA (gRNA) which will lead Cas9 to its target DNA. One such strategy to investigate host-pathogen interaction, is called ‘in vivo pathogen genome targeting’. Cas9 is integrated into the host genome and programmed to induce DSBs in a vital locus of a certain virus. Upon infection of the host, Cas9 and the gRNA target the viral genome, induce DSBs, and inhibit replication. Such strategy has been successfully employed to generate chickens resistant to Marek’s disease. Another study modified wild boar lung cells to express Cas9 and target the CP204L gene of ASFV. CP204L transcribes p30, a protein crucial for ASFV replication, and upon infection the modified cells displayed significantly reduced viral replication. In this project, we generated pigs based on an in vivo pathogen genome targeting strategy targeting the essential CP204L gene of ASFV. Foetal porcine fibroblasts were modified and used as donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT) followed by embryo transfers. The cloning efficiencies ranged from 4.7 to 13.6 %. In total, 17 pigs were generated which carried the Cas9 and gRNA integrations. While it is essential for the in vivo pathogen genome targeting strategy that the integrated Cas9 can induce DSBs, fibroblasts of the transgenic pigs were isolated and subjected to in vitro experiments. The Cas9 expressing fibroblasts were transfected with gRNAs targeting different porcine loci (GGTA1, B4GALNT2NT2, B2M). The transfection with gRNAs led to DSBs in the porcine genome of the transfected cells which was confirmed by Sanger sequencing, next generation sequencing and flow cytometry. Therefore, the transfected gRNAs guided the translated Cas9, which was integrated into the porcine genome to the target sequence. The experiments validated that the Cas9 sequence was not only integrated into the porcine genome but also that the protein was successfully translated. Based on these findings and the inhibition of viral replication in modified wild boar lung cells, the transgenic pigs were admitted to an ASFV infection study. Seven control and seven transgenic pigs were infected, each with approximately 105 TCID50 (50 % Tissue Culture Infectious Dose) of a highly virulent ASFV isolate. No differences between control and transgenic pigs were observed in terms of disease development, indicating that ASFV was still able to replicate within the transgenic pigs. In conclusion, Cas9 expression in the pigs was sufficient to induce genome edits within the porcine genome but not to protect the animals from ASF infection.
Das Hausschwein ist als globale Proteinquelle von unschätzbarem Wert. Die Schweinefleischproduktion steht jedoch häufig vor Herausforderungen, die durch Ausbrüche von Viruserkrankungen verursacht werden. Zum Bespiel hat das Virus, das die Afrikanische Schweinepest (ASP) verursacht, im Jahr 2014 Osteuropa und 2020 Deutschland erreicht. Das Virus verursacht bei Haus- und Wildschweinen eine Sterblichkeitsrate von fast 100 %. Bislang gibt es keine Behandlungsmöglichkeiten oder Impfstoffe, und die Eindämmung des Virus hängt von strengen Biosicherheitsmaßnahmen ab. Daher ist es von großer Bedeutung, die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Virus zu verstehen, um die Entwicklung von Impfstoffen und/oder antiviralen Medikamenten zu unterstützen. Mit Hilfe von Genom-Editierungs Technologien wie CRISPR-Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats und assoziiertes Protein) ist es möglich, die Infektionsmechansisms zwischen Wirt und Erreger gezielt zu erforschen und ein besseres Verständnis zu schaffen, indem das Genom des Wirts oder des Erregers verändert wird. Das CRISPR-Cas9 System besteht aus zwei Hauptkomponenten: der Cas9-Endonuklease, die Doppelstrangbrüche (DSBs) in der DNA induziert, und einer RNA (guideRNA), die Cas9 zu seiner Ziel-DNA führt. Eine dieser Strategien um Infektionsmechanismen zu verstehen, ist das so genannte „in vivo pathogen genome targeting". Bei dieser Strategie wird Cas9 in das Wirtsgenom integriert und so programmiert, dass es DSBs in einem lebenswichtigen Gen eines bestimmten Virus induziert. Nach der Infektion des Wirts greifen Cas9 und die gRNA das virale Genom an, induzieren DSBs und hemmen die Replikation. Diese Strategie wurde bereits erfolgreich eingesetzt, um Hühner zu erzeugen, die gegen die Marek-Krankheit resistent sind. Zudem wurden Lungenzellen von Wildschweinen so modifiziert, dass sie Cas9 exprimieren und das CP204L-Gen im ASP Virus angreifen. CP204L, das Protein 30 transkribiert, ist für die Replikation des ASP Viruses von entscheidender Bedeutung. Bei einer Infektion der Lungenzellen zeigten die modifizierten Zellen eine deutlich reduzierte Virusreplikation. In diesem Projekt haben wir Schweine auf der Grundlage einer „in vivo pathogen genome“ Strategie erzeugt, die auf das essentielle CP204L-Gen des ASP Viruses abzielt. Fötale Schweinefibroblasten wurden modifiziert und als Spenderzellen für den somatischen Zellkerntransfer mit anschließendem Embryotransfer verwendet. Die Kloneffektivität lag zwischen 4,7 und 13,6 %. Insgesamt wurden 17 Schweine erzeugt, die die Cas9-Integrationen trugen. Da es für die „in vivo pathogen genome targeting“ Strategie wichtig ist, dass das integrierte Cas9 DSBs induzieren kann, wurden Fibroblasten der transgenen Schweine isoliert und in vitro-Experimenten unterzogen. Die Cas9-exprimierenden Fibroblasten wurden mit guideRNAs transfiziert, die auf verschiedene bekannte Schweine-Loci abzielen (GGTA1, B4GALNT2NT2, B2M). Die Transfektion mit guideRNAs führte zu DSBs im Genom der transfizierten Zellen, was durch Sanger-Sequenzierung, Next Generation Sequencing und Durchflusszytometrie bestätigt wurde. Die guideRNAs leiteten also das translatierte Cas9, das in das Schweinegenom integriert wurde, zur Zielsequenz. Die Experimente bestätigten, dass die Cas9-Sequenz nicht nur in das Schweinegenom integriert wurde, sondern auch, dass das Protein erfolgreich translatiert wurde. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse und der erfolgreichen Hemmung der Virusreplikation in modifizierten Wildschwein-Lungenzellen wurden die transgenen Schweine in eine ASP-Infektionsstudie aufgenommen. Sieben Kontrollschweine und sieben transgene Schweine wurden jeweils mit etwa 105 TCID50 (50 % Tissue Culture Infectious Dose) eines hochvirulenten ASP-Isolats infiziert. Hinsichtlich der Krankheitsentwicklung wurden keine Unterschiede zwischen Kontroll- und transgenen Schweinen festgestellt, was darauf hindeutet, dass sich das ASP Virus in den transgenen Schweinen weiterhin vermehren konnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Cas9-Expression in den Schweinen ausreichte, um Genom-Editierungen im Schweinegenom zu induzieren, aber nicht, um die Tiere vor einer ASP-Infektion zu schützen.
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