Genetic determinants for virulence and adaptation of avian influenza virus subtype H4N2 in chickens and subtype H10N7 in mammals
Avian influenza viruses (AIVs) have their natural reservoir in wild aquatic birds but occasionally spread to terrestrial poultry. While AIVs of subtypes H5 and H7 are well known to evolve highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs) during circulation in domestic birds, non-H5/H7 subtypes exhibit only a low to moderate pathogenicity. Furthermore, spillover events to a broad range of mammalian hosts, including humans, with self-limiting to severe illness or even fatal outcomes, were reported for non-H5/H7 AIVs and pose a pandemic risk. The evolution of high virulent phenotypes in poultry and the adaptation of AIVs to mammalian hosts are predominantly linked to genetic determinants in the hemagglutinin (HA). The acquisition of a polybasic cleavage site (pCS) is a prerequisite for the evolution of HPAIVs in poultry, while changes in the receptor binding preference and virus stability are essential for adaptation of AIVs to mammals. In August 2012, an H4N2 virus with the pCS motif 322PEKRRTR/G329 but preserved trypsin dependend replication and low pathogenicity in chickens was isolated on a quail farm in California. In the first two publications, we followed different approaches to investigate virulence factors and the potential risk for the transition of H4N2 to high virulence in chickens. The loss of N-terminal glycosylations in the vicinity of the pCS resulted in decreased binding to avian-like receptors and dramatically decreased virus stability. On the other hand, one deglycosylation increased virus replication and tissue tropism in chicken embryos but did not alter virulence or excretion in chickens. Furthermore, additional basic amino acids in the natural pCS motif improved the trypsin-independent cleavage of HA and caused slightly increased tissue tropism in chickens. However, the engineered motifs alone did not affect virulence in chickens. Intriguingly, they even had a detrimental effect on virus fitness, which was restored after reassortment with segments of HPAIV H5N1. Together, the results show the importance of HA glycosylations on the stability of H4N2 and reveal the important role of non-HA segments in the transition of this virus to high virulence in poultry. The transmission of another non-H5/H7 AIV of subtype H10N7 from birds to seals resulted in mass deaths in harbor seals in 2014 in northern Europe. The third publication describes nine mutations in the HA1 subunit of seal isolates compared to avian H10Nx viruses. We found that some of these mutations conferred a dual specificity for avian and mammalian receptors and altered thermostability. Nevertheless, the H10N7seal remained more adapted to avian host cells, despite of the alteration in the receptor binding specificity. Altogether, this thesis demonstrates that naturally evolved AIVs beside H5 and H7 subtypes support a highly pathogenic phenotype in the appropriate viral background and alter virulence and host receptor specificity by few amino acid substitutions in the HA. These findings improve our knowledge of the potential of non-H5/H7 AIVs to shift to high virulence in birds and the adaptation in mammals.
Aviäre Influenzaviren (AIVs) haben ihr natürliches Reservoir in wilden Wasservögeln, werden jedoch auch auf Landgeflügel übertragen. Im Gegensatz zu AIVs der Subtypen H5 und H7, welche hochpathogene aviäre Influenzaviren (HPAIVs) während der Zirkulation in domestizierten Vögeln entwickeln können, verursachen nicht-H5/H7 Subtypen lediglich eine niedrige bis moderate Pathogenität. Infektionen von Säugetieren, darunter Menschen, mit nicht-H5/H7 AIVs führten zudem zu selbstlimitierenden bis schweren Krankheitsverläufen teils mit tödlichen Folgen und stellen somit ein pandemisches Risiko dar. Die Entwicklung hochvirulenter Phänotypen in Geflügel und die Anpassung von AIVs an Säugetierwirte sind vorrangig auf genetische Faktoren im Hämagglutinin (HA) zurückzuführen. Der Erwerb einer polybasischen Spaltstelle (pCS) ist eine Voraussetzung für die Bildung von HPAIVs in Geflügel, wohingegen Veränderungen der Rezeptorbindungspräferenz und der Virusstabilität für die Anpassung an Säuger maßgeblich sind. Im August 2012 wurde ein H4N2 Virus mit dem pCS Motiv 322PEKRRTR/G329 auf einer Wachtelfarm in Kalifornien isoliert, welches jedoch weiterhin Trypsin-abhängig replizierte und eine niedrige Pathogenität in Hühnern aufwies. In den ersten beiden Publikationen verfolgten wir verschiedene Ansätze zur Untersuchung von Virulenzfaktoren und dem Potenzial von H4N2, eine hohe Virulenz in Hühnern zu induzieren. Der Verlust N-terminaler Glykosylierungen in Umgebung der pCS führte zu reduzierten Bindungspräferenzen für vogelartige Rezeptoren und geringen Virusstabilitäten. Eine Deglykosylierung führte zu einer verbesserten Virusreplikationen und verbreiterten Gewebetropismen in Hühnerembryonen, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Virulenz oder Ausscheidung in Hühnern. Zusätzliche basische Aminosäuren im natürlichen pCS Motiv führten zu Trypsin-unabhängigen HA-Spaltungen und gesteigerten Gewebetropismen, hatten allein aber keinen Einfluss auf die Virulenz und sogar einen nachteiligen Effekt auf die Virusfitness, welche allerdings durch Reassortierung mit HPAIV H5N1 Segmenten wiederhergestellt wurden. Die Ergebnisse zeigen sowohl die Bedeutung von HA-Glykosylierungen für die Stabilität von H4N2, als auch die Relevanz für Nicht-HA Segmente bei der Ausbildung hoher Virulenzen auf. Die Transmission von Vögeln auf Seehunde eines anderen nicht-H5/H7 AIV vom Subtyp H10N7 führte 2014 zu einem Massensterben von Seehunden in Nordeuropa. Die dritte Publikation beschreibt neun Mutationen der HA1-Untereinheit in Seehundisolaten im Vergleich zu aviären H10Nx Viren. Wir fanden heraus, dass einige dieser Mutationen eine duale Spezifität für aviäre und Säugetierrezeptoren verleihen und die Thermostabilität verändern. Trotz der veränderten Rezeptorspezifität ist H10N7seal jedoch weiterhin stark an aviäre Wirtszellen adaptiert. Zusammengefasst demonstriert die vorliegende Arbeit, dass natürliche AIVs, neben H5 und H7 Subtypen, einen hochpathogenen Phänotyp im geeigneten viralen Hintergrund unterstützen und die Virulenz sowie die Wirtsrezeptorspezifität durch Substitution weniger Aminosäuren im HA beeinflusst werden. Diese Forschungsergebnisse verbessern unsere Kenntnisse zum Potenzial von Nicht-H5/H7 AIVs, hohe Virulenzen in Vögeln zu entwickeln und an Säugetiere zu adaptieren.
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