Evaluierung des diagnostischen Potenzials des rekombinanten Coxiella burnetii-Com1 Proteins für den serologischen Nachweis von Q-Fieber bei Schafen, Ziegen und Rindern
Coxiella burnetii (C. burnetii) ist der Erreger des Q-Fiebers, einer zoonotischen Erkrankung, welche insbesondere kleine und große Wiederkäuer betrifft. Während Tiere meist asymptomatisch erkranken, kann die Erkrankung beim Menschen von akuten grippeähnlichen Symptomen bis hin zur chronischen Organschädigung führen. Die Diagnostik von Q-Fieber im veterinärmedizinischen Bereich wird durch unspezifische Symptome sowie diagnostische Lücken erschwert: Einerseits ist die direkte Diagnostik aufgrund langer Anzuchtzeiten der Bakterien häufig unpraktikabel. Andererseits weisen die Leistungen der Serodiagnostika in Untersuchungen teilweise inakzeptable Spezifitäten und Sensitivitäten auf. - Ziel der Untersuchungen - Ziel war es, das Potential des rekombinant hergestellten C. burnetii Außenmembran-proteins Com1 als diagnostischen Marker zu bestimmen und darauf aufbauend einen indirekten Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zu entwickeln, welcher die Grundlage für neue, praxistaugliche und verbesserte Serodiagnostika bieten kann. - Material und Methoden - Hierfür wurde die kodierende Sequenz für Com1 von C. burnetii Nine Mile Phase II RSA 439 unter Ausschluss der Signalsequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das Amplifikat com1 wurde in ein Expressionsplasmid kloniert und anschließend mittels Transformation in Escherichia coli (E. coli) als Com1 exprimiert. Das Expressionsprodukt wurde nach der Aufreinigung über Nickel-NTA (Nitrilotriessigsäure) mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), Coomassie-Blau-Färbung und Western Blot überprüft. Die 96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit 1 µg/Well des rekombinanten Proteins beschichtet und 404 Seren von Schafen (111), Ziegen (100) und Rindern (193) auf ihre Reaktion im rekombinanten Com1-ELISA analysiert. Die Seren stammten sowohl aus definierten Ausbrüchen als auch aus Q-Fieber-freien Beständen, geimpften Herden und von Tieren mit fraglichem Infektionshintergrund. Daneben wurden die Seren mit kommerziellen ELISAs getestet und daraufhin in positive und negative Seren eingeteilt. Die OD450-Werte (optische Dichte bei 450 nm) der Seren aus dem rekombinanten Com1-ELISAs wurden in Pivot-Tabellen angeordnet und anschließend in einer ROC-Kurve (receiver operating characteristic) dargestellt, wodurch das Integral als Area under the curve (AUC) berechnet und hinsichtlich der Diskrimination zwischen positiven und negativen Ergebnissen ausgewertet wurde. Nach Festlegung von tierart-spezifischen Cut-off-Werten wurden Sensitivität und Falsch-Positiv-Rate bestimmt. - Ergebnisse - Die ermittelten tierart-spezifischen OD450-Cut-off-Werte betrugen für Schafe 0,32, für Ziegen 0,23 und für Rinder 0,18. Als Spezifität bzw. Sensitivität ergaben sich für Schafe 85 % bzw. 68 %, für Ziegen 94 % bzw. 77 % und für Rinder 71 % bzw. 70 %. Die Diskrimination wurde bei Schafen als „exzellent“, bei Ziegen als „herausragend“ und bei Rindern als „akzeptabel“ eingeschätzt. - Schlussfolgerungen - Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das Coxiella-Außenmembranprotein Com1 als Basis für die Entwicklung neuer, sensitiverer und spezifischerer (Schnell)-Diagnostika dienen kann, um weitere Q-Fieber-Epidemien einzudämmen und damit das Risiko einer C. burnetii-Infektion für Mensch und Tier zu minimieren.
Coxiella burnetii (C. burnetii) is the causative agent of Q fever, a zoonotic disease with small and large ruminants as the target hosts. While an infection in ruminants is often symptomless, the disease in humans can lead from acute flu-like symptoms to chronic organ damage. In addition to the non-specific symptoms in the veterinary field, for which reason it is difficult to directly conclude on a Q fever outbreak, the detection of infections with C. burnetii is in need of improvement. On the one hand, direct diagnosis is often impracticable due to long cultivation periods of the bacteria. On the other hand, the performance of serodiagnostics shows partially unacceptable specificities and sensitivities. - Objectives - The aim of the study was to determine the potential of the recombinantly produced C. burnetii outer membrane protein Com1 as a diagnostic marker and, subsequently, to develop an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which can provide the basis for the development of new and improved serodiagnostics. - Material and methods - For this purpose, primers for com1 were designed in silico and the open reading frame (ORF) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using phenol-chloroform-isolated DNA (deoxyribonucleic acid) from C. burnetii Nine Mile Phase II RSA 439 without signal sequence. After control by gel electrophoresis, the amplified product was cloned into the two-stage gateway system (Invitrogen) and transformed into Escherichia coli (E. coli) TOP10. The expression vector was cloned into E. coli BL21(DE3) and Com1 was expressed. The protein was analyzed after native purification via Nickel-NTA (nitrilotriacetic acid) by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), Coomassie blue staining and Western blot and subsequently concentrated. Microtiter plates were coated with the recombinant protein and 404 sera from sheep (111), goats (100) and cattle (193) were tested for their reaction in the recombinant Com1-ELISA. The sera were derived from 36 different flocks, both from defined outbreaks and from Q fever-free flocks, vaccinated herds and from animals with questionable infection background. In addition, the sera were tested with commercial ELISAs and could thus be divided into positive and negative sera. The OD450 values (optical density at 450 nm) of the sera from the recombinant Com1 ELISAs were arranged in pivot tables and then plotted on a ROC curve (receiver operating characteristic), allowing the integral to be calculated as the area under the curve (AUC) and evaluated regarding the discrimination between positive and negative results. After establishing animal species-specific cut-off values, sensitivity and false positive rate were determined. - Results - The animal species-specific OD450 cut-off values determined were 0.32 for sheep, 0.23 for goats and 0.181 for cattle. Specificity and sensitivity were 85 % and 68 % for sheep, 94 % and 77 % for goats and 71 % and 70 % for cattle. Discrimination was assessed as 'excellent' in sheep, 'outstanding' in goats and 'acceptable' in cattle. - Conclusions - The results of this study suggest that the Coxiella outer membrane protein Com1, together with other immunogenic marker proteins, may serve as a basis for the development of new more sensitive and specific diagnostic tools to contain further Q fever epidemics and thus minimize the risk of C. burnetii infection for humans and animals. Com1 could also lay the foundation for direct rapid diagnostics.
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