Functionel analysis of the molecular interactions between ebolaviruses and host proteins

Ebolaviruses are zoonotic pathogens causing severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates with high case fatality rates. In recent years, the number and scope of outbreaks has increased, highlighting the importance of better understanding the molecular aspects of ebolaviral infection and host cell interactions in order to be able to better control this virus. To facilitate virus genome replication, transcription and protein expression, ebolaviruses recruit and interact with specific host factors. These interactions play a key role in viral infection and influence virus survival and disease outcome. Based on a genome-wide siRNA screen, the three host factors CAD, NXF1 and UAP56 were recently identified to be involved in ebolavirus genome replication and/or transcription and/or mRNA-translation. However, mechanistical details of how these host factors affect the ebolavirus lifecycle remained elusive. In this thesis I analyzed the functional interactions between EBOV and these newly identified host proteins in order to better understand the virus-host interface. To this end I used siRNA knockdown as well as overexpression of these host proteins in combination with different reverse-genetics based lifecycle modelling assays to investigate the influence of CAD, NXF1 and UAP56 on individual aspects of the EBOV lifecycle. Using these systems in relation with a host factor knockdown I was able to show that the provision of pyrimidines by CAD plays an important role for both EBOV genome replication and transcription, whereas NXF1 is predominantly required for mRNA transport. I furthermore used immunofluorescence analysis to examine whether these host factors are recruited by one or more EBOV proteins to inclusion bodies, which represent physical sites of ebolavirus genome replication. During these experiments, I was able to show that CAD and NXF1, and possibly also UAP56, are recruited to EBOV inclusion bodies in order to fulfill their individual function for EBOV RNA synthesis or later steps in protein expression. Additionally, I was able to show that the uptake of NXF1 into NP-induced inclusion bodies is most likely mediated via the C-terminal domain of NP, and that the FG-repeat interaction domains of NXF1 are sufficient for recruitment. Further, my data indicate that RNA interaction of both NXF1 and NP is not required for this process, but rather important for exit of NXF1 from inclusion bodies. I therefore suggest that the viral mRNA is transferred in inclusionbodies from NP to NXF1, which leads to a rapid export of the NXF1 packed viral mRNA into the cytosol for mRNA translation. The exact mechanism of how these host factors are recruited into inclusion bodies and whether they have similar functions in the lifecycle of other negative-sense RNA viruses still needs to be investigated. Nevertheless, this study increases our understanding of virus-host interaction of ebolaviruses, and thus helps to identify targets for the development of novel therapeutics against these viruses.

Ebolaviren sind zoonotische Krankheitserreger, die bei Menschen und Primaten schwere hämorrhagische Fieber mit einer hohen Sterblichkeitsrate verursachen. In den letzten Jahren haben die Anzahl und der Umfang von Ausbrüchen zugenommen. Um diese Infektionen besser bekämpfen zu können, ist es daher von großer Bedeutung, ein besseres Verständnis über die molekularen Aspekte einer ebolaviralen Infektion und Wechselwirkungen von Ebolaviren mit der Wirtszelle zu erlangen. Um eine effektive Virusreplikation, -transkription und -translation zu gewährleisten, rekrutieren und interagieren Ebolaviren mit verschiedenen Wirtsfaktoren. Diese Wechselwirkungen spielen eine Schlüsselrolle bei der Virusinfektion und haben Einfluss auf das Überleben des Virus und den Krankheitsverlauf. Basierend auf einem genomweiten siRNA-Screening konnten die drei Wirtsfaktoren CAD, NXF1 und UAP56 identifiziert werden, welche an der Replikation und/oder Transkription und/oder mRNA-Translation des Ebolavirus-Genoms beteiligt sind. Mechanistische Details darüber, wie diese Wirtsfaktoren im Ebolavirus-Lebenszyklus eine Rolle spielen, waren jedoch bislang nicht bekannt. Um die Schnittstelle zwischen Virus und Wirt besser zu verstehen, habe ich in dieser Doktorarbeit die funktionellen Wechselwirkungen zwischen Ebolaviren und diesen drei neu identifizierten Wirtsfaktoren analysiert. Zu diesem Zweck verwendete ich verschiedene auf reverser Genetik basierende Lebenszyklusmodellierungssysteme in Kombination mit siRNA-Knockdown oder Überexpression dieser Wirtsproteine, um den Einfluss von CAD, NXF1 und UAP56 auf einzelne Aspekte des Ebolavirus-Lebenszyklus zu untersuchen. Mittels dieser Modellsysteme und einem Knockdown der Wirtsfaktoren konnte ich zeigen, dass die Bereitstellung von Pyrimidinen durch CAD sowohl für die Replikation als auch für die Transkription des EBOV-Genoms eine wichtige Rolle spielt, während NXF1 vorwiegend für den mRNA-Transport erforderlich ist. Des Weiteren verwendete ich Immunfluoreszenzanalysen, um zu untersuchen, ob diese Wirtsfaktoren von einem oder mehreren Ebolavirus-Proteinen in Einschlusskörperchen, welche Orte der Ebolavirus-Genomreplikation darstellen, rekrutiert werden. Im Verlauf dieser Experimente konnte ich zeigen, dass CAD, NXF1 und möglicherweise auch UAP56 in Ebolavirus-Einschlusskörperchen rekrutiert werden, um ihre individuellen Funktionen in der Ebolavirus-RNA-Synthese oder Protein-Expression zu erfüllen. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die Aufnahme von NXF1 in NP-induzierte Einschlusskörperchen über die C-terminale Domäne von NP vermittelt wird, und die FG-Repeat-Interaktionsdomänen von NXF1 hierfür hinreichend sind. Obwohl eine RNA-Interaktion von NXF1 oder NP für diese Aufnahme nicht benötigt wird, scheint diese für den Export von NXF1 aus den Einschlusskörpern entscheidend zu sein. Es ist daher zu vermuten, dass die virale mRNA in Einschlusskörpern von NP auf NXF1 übertragen wird. Dies führt wiederum zu einem schnellen Export der NXF1-gebundenen viralen mRNA in das Zytoplasma und zur mRNA Translation. Unklar bleibt jedoch, wie genau diese Wirtsfaktoren in Einschlusskörper rekrutiert werden, und ob sie ähnliche Funktionen im Lebenszyklus anderer RNA-Viren mit negativer Polarität haben. Dennoch haben diese Untersuchungen unser Verständnis über die Virus-Wirt-Interaktion von Ebolaviren verbessert und dazu beigetragen, Ziele für die Entwicklung neuartiger Therapeutika gegen diese Viren zu identifizieren.

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