Genetic determinants for virulence and adaptation of avian influenza viruses H9N2 and H5N8 subtypes in poultry and mammals

LPAIV H9N2 and HPAIV H5N8 clade 2.3.4.4 viruses have been frequently isolated from domestic and wild birds in Germany and they are endemic in poultry worldwide. H9N2 is known to donate gene segments to other AIV with high case fatality rate in humans (e.g. H5N1, H7N9). Similarly, H5N8 devastated poultry worldwide since 2014 and has been recently isolated from humans. Therefore, it is important to understand the genetic predisposition for adaptation of H9N2 and H5N8 AIV in poultry and mammals. In the first publication, we focused on the variable hemagglutinin cleavage site (HACS) of European and Non-European H9N2 viruses, since the HACS is a main virulence determinant of AIV in birds. We found a preferential substitution of non-basic amino acids (G, A, N, S, D, K) in the HACS at position 319 of European H9N2 viruses compared to non-European H9N2 viruses. Recombinant viruses carrying different non-basic amino acids in the HACS modulated replication in vitro. While these non-basic amino acids did not affect virulence or transmission in chickens, they modulated virulence and replication in turkeys. Moreover, H9N2 viruses with non-basic amino acids in the HACS were able to replicate in mammalian brain cells for multiple cycles even without trypsin. In the second publication, we addressed the question whether reassortment between two recent German H9N2 and H5N8 clade 2.3.4.4. B viruses is possible and analysed the impact on virus fitness in mammals and birds. We found that H9N2 PB1 and NP segments were not compatible to generate infectious H5N8 viruses and this incompatibility was due to mutations outside the packaging region. However, H9N2 NS alone or in combination with PB2 and PA significantly increased replication of H5N8 in human cells. Moreover, H9N2 PB2, PA and/or NS segments increased virulence of H5N8 in mice. Interestingly, in chickens, reassortment with H9N2 gene segments, particularly NS, partially or fully impaired chicken-to-chicken transmission. These results indicate that the evolution of H9N2/H5N8 reassortants showing high virulence for mammals is unlikely to occur in chickens. In the third publication, we focused on the NS1 protein of different HPAIV H5N8 clade 2.3.4.4 viruses from 2013 to 2019 and studied the impact of its C-terminus (CTE) variation on virus fitness in chickens and ducks. Our findings revealed a preferential selection for a certain NS1 CTE length in 2.3.4.4. H5N8 clade A (237 aa) and B (217 aa) viruses over the common length of 230 aa. Indeed, the NS1 CTE can affect virus virulence and pathogenesis in a species and virus clade dependent manner. In chickens, although there was no impact on virulence, NS1 CTE of H5N8-A and H5N8-B, regardless of the length, have evolved towards higher efficiency to block the IFN response. In ducks, NS1 CTE contributed to efficient transmission, replication and high virulence of H5N8-B. In the fourth publication, we assessed the impact of variable length of NS1 on H5N8 virus replication in human cells and virulence in mice. We showed that NS1 of H5N8-B virus unlike the vast majority of NS1 of AIV, shared preferences for short NS1 similar to human and zoonotic influenza viruses. This virus (i) was able to efficiently block IFN and apoptosis induction which might be the first steps for efficient adaptation to human cells and (ii) without prior adaptation replicated at higher levels and was more virulent in mice than H5N8-A. The virulence of the latter virus increased after shortening the NS1 similar to H5N8-B virus. Therefore, it is conceivable that truncation in NS1 is a determinant for adaptation of H5N8 in mammals irrespective of its impact on virus fitness in poultry. Findings in this dissertation indicated that HA mutations in the European H9N2 and NS1 variations in H5N8 viruses play a role in virus fitness in poultry and/or mammals. These results improve our current understanding for AIV adaptation and are useful to assess the potential of these viruses to infect mammals.

Das niedrigpathogene aviäre Influenzavirus (LPAIV) H9N2 und das hochpathogene aviäre Influenzvirus (HPAIV) H5N8 Klade 2.3.4.4 sind weltweit in Geflügelbeständen endemisch und werden häufig von Nutz- und Wildvögeln in Deutschland isoliert. H5N8 wird seit 2014 weltweit in Geflügelbeständen nachgewiesen und wurde kürzlich auch in Menschen nachgewiesen. H9N2 kann Gensegmente an andere aviäre Influenzaviren abgeben, die mit hohen Sterblichkeitsraten beim Menschen verbunden sind (z. B. H5N1, H7N9). Daher ist es wichtig, die genetische Prädisposition für die Anpassung von H9N2 und H5N8 AIV bei Geflügel und Säugetieren zu verstehen. In der ersten Veröffentlichung konzentrierten wir uns auf die variable Hämagglutinin-Spaltstelle (HACS) der H9N2 Viren, da die HACS eine wesentliche Virulenzdeterminante von AIV bei Vögeln ist. Wir fanden eine bevorzugte Substitution von nicht-basischen Aminosäuren (G, A, N, S, D) an Position 319 des HA bei europäischen H9N2 Viren im Vergleich zu nicht-europäischen H9N2 Viren. Wurden diese Veränderungen in gezielt rekombinante Viren eingefügt, veränderte dies die Replikation in der Zellkultur. Während nicht-basische Aminosäuren die Virulenz oder Übertragung bei Hühnern nicht beeinflussten, modulierten sie die Virulenz und Replikation bei Puten. Darüber hinaus konnten sich H9N2 Viren mit nicht-basischen Aminosäuren in der HACS auch ohne Trypsin über mehrere Zyklen hinweg in Gehirnzellen von unterschiedlichen Säugetieren replizieren. In der zweiten Veröffentlichung gingen wir der Frage nach, ob ein Genaustausch zwischen zwei rezenten deutschen Viren (H9N2 und H5N8 der Klade 2.3.4.4 B) möglich ist und analysierten die Auswirkungen auf die Virusinfektion bei Säugetieren und Vögeln. Wir fanden heraus, dass die PB1- und NP-Segmente von H9N2 nicht mit den anderen Segmenten von H5N8 kompatibel waren, keine infektiösen Nachkommenviren entstanden und dass diese Inkompatibilität auf Mutationen außerhalb der Verpackungsregionen der Gensegmente zurückzuführen war. Der Austausch der homologen H5N8 Segmente gegen das H9N2 NS Segment allein oder in Kombination mit PB2 und PA erhöhte jedoch die Replikation von H5N8 in menschlichen Zellen erheblich. Außerdem erhöhten die H9N2 PB2-, PA- und/oder NS-Segmente die Virulenz von H5N8 in Mäusen. Interessanterweise beeinträchtigte der Genaustausch, insbesondere NS, die Übertragung von Huhn zu Huhn. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Evolution von H9N2/H5N8-Reassortanten mit hoher Virulenz für Säugetiere bei Hühnern eher unwahrscheinlich ist. In der dritten Veröffentlichung konzentrierten wir uns auf das NS1-Protein verschiedener HPAIV H5N8 Viren der Klade 2.3.4.4 aus den Jahren 2013 bis 2019 und untersuchten die Auswirkungen der Variation des C-Terminus (CTE) auf die Virusfitness bei Hühnern und Enten. Unsere Ergebnisse zeigten eine bevorzugte Selektion für eine bestimmte NS1 C-Terminus Länge in H5N8 Viren der Klade A (237 aa) und B (217 aa) gegenüber der häufigen Länge von 230 aa. Tatsächlich kann der NS1 CTE die Virulenz und Pathogenese in Abhängigkeit von der Spezies und der Virusklade beeinflussen. Bei Hühnern hatte der NS1 CTE von H5N8-A und H5N8-B, unabhängig von der Länge, zwar keinen Einfluss auf die Virulenz, aber er hat sich zu einer höheren Effizienz bei der Blockierung der IFN-Antwort entwickelt. Bei den Enten trug der NS1 CTE von H5N8-B zur effizienten Übertragung, Replikation und hohen Virulenz bei. In der vierten Veröffentlichung untersuchten wir die Auswirkungen der variablen Länge von NS1 auf die Replikation des H5N8 Virus in menschlichen Zellen und die Virulenz in Mäusen. Wir konnten zeigen, dass das H5N8-B Virus im Gegensatz zur großen Mehrheit der NS1 Proteine von AIV eine Präferenz für ein kurzes NS1 hat, ähnlich wie bei menschlichen und zoonotischen Influenzaviren. Dieses Virus war (i) in der Lage, die Interferon- und Apoptoseinduktion wirksam zu blockieren, was erste Schritte für eine effiziente Anpassung an menschliche Zellen sein könnten, und (ii) replizierte ohne vorherige Anpassung zu höheren Titern und war in Mäusen virulenter als H5N8 der Klade A. Die Virulenz des H5N8 der Klade A Virus nahm nach Verkürzung des NS1 zu, ähnlich wie beim H5N8-B Virus. Deshalb ist es denkbar, dass die Verkürzung von NS1 ein entscheidender Faktor für die Anpassung von H5N8 an Säugetiere ist, unabhängig von den Auswirkungen auf die Infektion bei Geflügel. Die Ergebnisse dieser Dissertation weisen darauf hin, dass HA-Mutationen in europäischen H9N2- und NS1-Variationen in H5N8- Viren eine Rolle bei der Virusreplikation und -übertragung bei Geflügel und/oder Säugetieren spielen. Diese Ergebnisse verbessern unser derzeitiges Verständnis der AIV-Anpassung und dienen einer besseren Einschätzung des Potenzials dieser Viren zur Infektion von Säugetieren.

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