In-depth genomic analyses of lyssaviruses

Lyssaviren, die Erreger der Tollwut, stellen eine lang bekannte Gefahr für Tiere und Menschen gleichermaßen dar. Ungeachtet zahlreicher Vakzinierungskampagnen für empfänglichen Hunde- und Wildtierpopulationen, welche als Reservoir für das prototypische Tollwutvirus dienen, ist die terrestrische Tollwut heutzutage noch immer für den Tod zehntausender Menschen jährlich verantwortlich. Hierbei ist eine fortlaufende Erweiterung der Gattung Lyssavirus durch die anhaltende Entdeckung neuer Spezies in bislang nicht betroffenen Fledermaus-Wirten über die letzten Jahre zu beobachten, die immer mehr Aufschluss über die tatsächliche Verbreitung, das Wirtsspektrum und Vielfalt dieser Viren gibt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die genetische Diversität der Lyssaviren EBLV-1, KBLV und RABV mit Hilfe detaillierter Genomanalysen untersucht, um weitere Einblicke in die Evolution von Lyssaviren zu gewinnen. Hierbei konnten phylogenetische und phylogeographische Analysen von EBLV-1 Vollgenomsequenzen sowohl neu sequenzierter dänischer EBLV-1 Fälle als auch in der Literatur beschriebener EBLV-1 Fälle eine höhere phylogeographische Struktur des EBLV-1-Cluster A1 nachweisen als dies in vorangegangenen Studien gezeigt werden konnte. Weiterhin konnte mit der Generierung der nahezu vollständigen Genomsequenz des Kotalahti bat lyssavirus die genetische Basis für die Klassifizierung von KBLV als neue Lyssavirusspezies gelegt werden. Weiterführende phylogenetische Untersuchungen konnten zudem die Zugehörigkeit von KBLV zu einer Gruppe Myotis-assoziierter Lyssaviren zeigen und liefern somit weitere Hinweise über die gemeinsame co-evolutionäre Entwicklung von Lyssaviren mit spezifischen Fledermausspezies. Unter Einsatz eines Tiefensequenzierverfahrens wurde darüber hinaus die hohe genetische Diversität von Viruspopulationen untersucht, wobei drei charakteristische Muster von Einzelnukleotid-Varianten identifiziert werden konnten, die in ERA-Vakzine-induzierten Fällen selektiert wurden. Hierbei konnte jedoch kein direkter Einfluss zwischen der genetischen Diversität der untersuchten Vakzinestämme und einer potentiellen Reversion hin zu einem virulenteren Virus bzw. eine spezies-spezifische Adaption beobachtet werden, wodurch die Ursache für die untersuchten Tollwutfälle weiterhin unklar bleibt. Zuletzt konnte die erfolgreiche Implementierung eines Hybridisierungs-Capturing-Verfahrens für die Generierung viraler Vollgenomsequenzen und der Anwendung in Variantenanalysen von RABV und KBLV durch die Nutzung eines diagnostischen Sets biotinylierter RNA Oligomeren demonstriert werden. Die erzielten Ergebnisse belegen hierbei die vielseitige Anwendungsmöglichkeit und Konsistenz des beschriebenen Verfahrens für die Untersuchung des genetischen Spektrums bekannter und neuer Lyssavirusspezies und bilden die Grundlage für den Einsatz und die Optimierung der Methode in zukünftigen Projekten. Zusammengefasst konnten die in dieser Arbeit präsentierten Studien die maßgebliche Bedeutung der vorgenommenen Untersuchungen auf der Sub-Konsensus-, Vollgenom- und Populationseben für die Erforschung der komplexen Evolution von Lyssaviren veranschaulichen, indem sie essentielle Informationen für das Verständnis der genetische Diversität der Gattung und deren Dynamiken im Langzeit- und mikroevolutionärem Maßstab bereitstellen.

Lyssaviruses, the causative agents of rabies, are a long-known threat for animals and humans. To date, terrestrial rabies still accounts for tens of thousands of human deaths annually, notwithstanding ambitious vaccination campaigns targeting susceptible dog and wildlife populations that act as reservoirs for the prototypic rabies virus. Moreover, the continuing discovery of newly emerging virus species in hitherto unconcerned chiropteran hosts and geographic regions drive the expansion of the Lyssavirus genus by unveiling its actual variety, host range and distribution.In this work, the genetic diversity of three distinct lyssaviruses, namely EBLV-1, KBLV and RABV, was elucidated by in-depth genomic analyses to provide further insight into lyssavirus evolution. The generation of full-genome sequences from primarily bat-associated Danish EBLV-1 samples significantly increased the number of available Danish EBLV-1 genome sequences while phylogenetic and phylogeographic analysis revealed a stronger phylogeographic structure for the cluster A1 of the sublineage EBLV-1a than it was postulated in previous studies. In addition, the acquisition of a nearly complete genome sequence for the Kotalahti bat lyssavirus provided the basis for the classification of this putative new lyssavirus species as a recognized member of the genus. Furthermore, phylogenetic analysis revealed the affiliation of KBLV to a group of Myotis-associated lyssaviruses giving a deeper insight into the shared evolutionary history of lyssaviruses co-evolving with particular bat species. Moreover, a deep-sequencing approach was utilized to assess the high genetic diversity of vaccine virus populations, uncovering three independent patterns of single nucleotide variants (SNVs) that became selected in ERA-related vaccine-induced cases. However, no apparent influence of the genetic diversity of vaccine viruses on microevolutionary processes like a potential reversion to virulence or a species-specific adaptation of the vaccine virus strains could be detected, leaving the question for the cause of rabies induction in the affected animals unanswered. Lastly, the successful implementation of a hybridization capturing system for the generation of full-genome sequences and deep-sequencing variant analyses of RABV and KBLV samples was demonstrated for a diagnostic bait set, highlighting the versatility and consistency of this approach to assess the genetic spectrum of known and novel lyssavirus species while setting the basis for its application and optimization in upcoming projects.In conclusion, as shown by the studies in this work, the investigation of lyssavirus genomes at the sub-consensus, full-genome and population level remains crucial to assess the complexity of lyssavirus evolution, as it provides an indispensable source of information to cover the diversity of the genus and understand evolutionary dynamics on a long-term and microevolutionary scale.

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