Molekulare und funktionale Analyse von Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnlichen Kinasen in P. x canescens

Zur Gewinnung von Bioenergie werden Pappeln als Energieholz auf Kurzumtriebsplantagen (KUPs) angebaut. Während der Wachstumsphase sind die Pappeln biotischen und abiotischen Umwelteinflüssen ausgesetzt. Eine Reduktion der Biomasse kann bei schadhaften Umwelteinflüssen wie Pilzbefall oder Trockenstress die Folge sein. Ertragseinbußen von bis zu 50 % können durch den biotrophen Pilz Melampsora spec. verursacht werden. Andere biotische Einflüsse, wie beispielsweise mykorrhizierende Pilze, können einen positiven Effekt auf das Pflanzenwachstum, insbesondere in Stresssituationen haben. Die pflanzliche Immunantwort wird über pathogen-associated molecular patterns (PAMP) nach Erkennung von pilzlichem Chitin über Lysin-Motiv-Rezeptor-ähnliche Kinasen (LysM-RLKs) vermittelt. Insgesamt 19 LysM-RKLs wurden in der Pappel annotiert, von denen vier für Nod-Factor Perception“ (NFP)-ähnliche Gene kodieren, die mutmaßlich an der Ausbildung einer Symbiose mit mykorrhizierenden Pilzen involviert sind. Die orthologen Gene zu den gewählten NFP-like-Kandidatengenen in Pappel sind in Medicago truncatula und Lotus japonicus an der Ausbildung einer Symbiose mit Knöllchenbakterien beteiligt. Auf Grund der Genomduplikation der Pappel liegen die NFP-like-Kandidatengene in paralogen Paaren vor. In silico- und Real-Time PCR-Analysen zeigten, dass das Kandidatengen NFP-like2 in dem verwendeten P. × canescens-Klon nicht vorhanden ist. Anhand von Expressionsanalysen konnte bestätigt werden, dass NFP-like3 und NFP-like4 eine wurzelassoziierte Funktion aufweisen. Jedoch konnte eine Expression dieser Kandidatengene auch in Blattgewebe nachgewiesen werden. Die Analysen ergaben, dass NFP-like1 in den untersuchten Geweben so gering exprimiert ist, dass ihm mutmaßlich keine Funktion zukommt. Zur Modifikation der NFP-like-Kandidatengene wurden CRISPR/Cas9-Konstrukte erzeugt, die in beiden Genen eines paralogen Paares eine Modifikation hervorrufen können. Es konnten transgene Linien erzeugt werden, die eine Einzelmodifikation, Doppelmodifikationen und Dreifachmodifikationen in den Kandidatengenen aufwiesen. Molekulargenetische Analysen der generierten transgenen Linien wurden genutzt, um Kandidatenlinien für Mykorrhizierungs- und Infektionsversuche mit Melampsora spec. auszuwählen. Die Kandidatenlinien zeigten im durchgeführten Mykorrhizierungsversuch kein verändertes Mykorrhizierungsverhalten. Allerdings konnte für einzelne transgene Linien eine gesteigerte Resistenz gegenüber Melampsora spec. beobachtet werden.

To produce bioenergy, poplar is grown on short rotation coppices (SRC). During the growth period, plants are exposed to biotic and abiotic environmental influences. A reduction in biomass can result from environmental factors such as fungal attack or drought. Yield losses of up to 50 % can be caused by the biotrophic rust fungi Melampsora spp. Other biotic influences such as mycorrhizal fungi can have positive effects on plant growth, especially during stress situations. Plant immune response is triggered by “pathogen associated molecular pattern” (PAMP) after detection of fungal chitin via Lysin-motif receptor-like kinases (LysM-RLK’s). Overall, a total of nineteen LysM-RLK’s were found in poplar, four of which encode for Nod factor perception (NFP)-like genes that are thought to have an impact on mycorrhization. The orthologous genes of the poplar NFP-like genes are essential for promoting mycorrhization with bacteria in Medicago truncatula und Lotus japonicus. Due to the duplication of the poplar genome, the NFP-like candidate genes are present in two paralog pairs. In silico and RT-PCR analysis showed that the candidate gene NFP-like2 is not present in the used P. × canescens clone. Expression analysis of all genes revealed that NFP-like3 and NFP-like4 have a root associated function. In addition, an expression of NFP-like3 and NFP-like4 was detected in leaf tissue. The slight expression level of NFP-like1 indicates that it is not functional in the analysed tissues. CRISPR/Cas9 constructs were created to modify NFP-like candidate genes in both genes of a paralog pair. Transgenic lines were generated that exhibited single modifications, double modification and triple modification. Molecular analyses of the generated transgene lines were used to screen for candidate lines to perform mycorrhization and Melampsora infection assays. In the mycorrhization assay conducted, there was no evidence of an altered mycorrhization potential of the analysed lines corresponding to the wildtype. Enhanced resistance was observed for separate transgene lines performing the Melampsora infection assay.

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