Isolierung und Identifizierung von Bakterien, die antagonistisch gegenüber holzzerstörenden Pilzen wirken - ein Potenzial für biologische Holzschutzmittel

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Wirkung von antagonistischen Bakterien gegenüber holzzerstörenden Pilzen durchgeführt. Ziel war es, von Baumborken isolierte Bakterienkolonien zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen, holzzerstörende Pilze in ihrem Wachstum zu hemmen oder gar ein Ansiedeln dieser zu verhindern. In Form von Freilandversuchen wurden Proben von der Borke verschiedener Baumindividuen genommen und mithilfe mikrobiologischer Methoden auf Agarplatten kultiviert. Dominant auftretende Bakterienarten wurden in Reinkultur gebracht und molekularbiologisch bestimmt. Weiterführend wurden das Wachstumsverhalten und die synergistischen bzw. antagonistischen Beziehungen der Pilz- und Bakterienarten untereinander untersucht, indem in Anlehnung an Oppermann (1951) Dualkulturen durchgeführt wurden. Zu den holzzerstörenden Pilzen zählten sieben Weißfäulepilze, u.a. Irpex lacteus, Trametes versicolor und Flammulina velutipes und zwei Braunfäulepilze, Daedalea quercina und Fomitopsis pinicola, die gegenüber den 46 ausgewählten Bakterienarten getestet wurden. Für die Auswertung der Dualtestreihe wurde die durch das Bakterium verursachte Wachstumshemmung der Schadpilze mit der Pilz-Kontrolle (ohne Bakterium) verglichen und nach Jeyaseelan & Jashothan (2012) mithilfe des Inhibitionsfaktors P [%] dargestellt. Je höher P [%] desto stärker der Antagonismus des jeweiligen Bakteriums. Da die Schadpilze den Bakterien-Isolaten unterschiedlich stark gegenübertraten, schwankten die Werte des Inhibitionsfaktors, auch innerhalb einer Bakterienart. Prozentuale Werte < 20 % konnten Bakterienarten zugeordnet werden, die keine große Hemmwirkung gegenüber den Schadpilzen bewirkten. Bakterien-Isolate der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus subtilis, kamen häufiger vor und wiesen Werte zwischen ca. 35 % (gegenüber Trametes versicolor) und ca. 80 % (gegenüber Stereum hirsutum) auf. Die Bakterienarten Pseudomonas fluorescens und Stenotrophomonas rhizophila hemmten das Wachstum des Schadpilzes Pleurotus ostreatus mit einem Inhibitionsfaktor von ca. 50 %. Nebst Ermittlung des Inhibitionsfaktors wurden die Dualkulturen am Ende der Versuchsreihe visuell begutachtet und in Anlehnung an Schreiner (2008) in vier Inhibitionsklassen unterteilt. Stark, gut und schwach hemmende Bakterienarten wurden den Klassen I-III zugeordnet, wobei die Klasse III (schwach hemmend) mit 44 % den größten Anteil ausmachte (Klasse I: 12 %; Klasse II: 22 %). In Klasse IV gruppierten sich mit einem Anteil von 22 % Bakterien-Isolate, deren Hemmwirkung gegenüber den Schadpilzen ausblieb. Darauf wurde eine Auswahl unterschiedlich stark hemmender und verschiedenartiger Bakterienarten der Klassen I und II getroffen, diese jeweils in Flüssigmedium kultiviert und für die Holzschutzmitteltestreihe zu zwei biologischen Lösungen zusammengemischt. In Anlehnung an die europäischen Normen zur Prüfung der Wirksamkeit von Holzschutzmitteln DIN EN 113 (1996-11) und DIN EN 152 (2011), wurden mit und ohne (Kontrolle) Bakterien-Lösung behandelte Prüfkörper der Holzarten Pinus sylvestris (Splintholz), Fagus sylvatica und Aesculus hippocastanum auf der mit dem jeweiligen Pilzmycel der Norm-Prüfpilze Trametes versicolor (Linnaeus ex Fries), Coniophora puteana (Schumacher ex Fries) und Aureobasidium pullulans (de Bary) bewachsenen Agarplatte positioniert. Dafür wurden zwei Gemische aus Bakterienarten der Gattungen Bacillus, Pseudomonas und Stenotrophomonas hergestellt und die Prüfkörper darin getränkt. Nach Kultivierung wurden diese in gewissen Abständen ausgebaut und der mittlere Masseverlust [%] einhergehend mit der Ausbaufeuchtigkeit der Pk bestimmt. Für den Bläuepilz A. pullulans wurde als Bewertungskriterium zudem der Bewuchs- und Verfärbungsgrad herangezogen. Die Testreihe ergab, dass die behandelten Prüfkörper ähnlich starke Verfärbungen aufwiesen wie die unbehandelten Prüfkörper. Eine Minderung der Verblauung durch das Auftragen des Gemischs B konnte nicht gezeigt werden. Die mit dem Gemisch A imprägnierten Prüfkörper der Holzart Pinus sylvestris wiesen nach 16 Wochen Versuchsdauer einen Masseverlust von ca. 2,5 % auf. Im Vergleich konnte bei den Kontrollen, die nur mittels Flüssigmedium, d.h. ohne Bakterien-Gemisch behandelt wurden, ein Holzabbau von ca. 28 % festgestellt werden. Auffallend dabei war die über den Zeitraum stark ansteigende Feuchtigkeit in den Holz-Prüfkörpern.

The following dissertation presents investigations that were carried out on the effect of antagonistic bacteria against wood-destroying fungi. The aim was to identify isolated bacterial colonies from tree bark, that have the ability to slow down wood-destroying fungi in their growth or even to prevent fungi from appearing in the first place. Field studies were undertaken by means of collecting samples from the bark of various tree species and cultivating the bacteria on agar plates using microbiological methods. The dominant bacterial species were isolated and determined using molecular biology. Additionally, the investigation also focused on growth behaviour and synergistic or antagonistic relationships between the fungal and bacterial species by performing dual cultures based on Oppermann (1951). In total 46 selected bacterial species were tested on wood-destroying fungi. This included seven white rot fungi, e.g. IIrpex lacteus, Trametes versicolor and Flammulina velutipes, and two brown rot fungi, Daedalea quercina and Fomitopsis pinicola. To evaluate the dual test series, the bacterium’s growth inhibition or reduction of the harmful fungi was compared with a fungus control group (without bacterium). The results were evaluated by using the inhibition factor P [%] in accordance to Jeyaseelan & Jashothan (2012). It was assumed that the higher the result in P [%], the stronger the antagonism effect would be, caused by the bacterium. However, it was also observed that the values of the inhibition factor fluctuated, even within one bacterial species. This can be explained by the fact that harmful fungi had faced the bacterial isolates in various degrees of concentration. Results with a percentage value less than 20 % were assigned to types of bacteria that did not have a major inhibitory effect on the harmful fungi. Bacterial isolates of the genus Bacillus, especially Bacillus subtilis, occurred more frequently and had values between approx. 35 % (compared to Trametes versicolor) and approx. 80 % (compared to Stereum hirsutum). The bacterial species Pseudomonas fluorescens and Stenotrophomonas rhizophila inhibited the growth of the harmful fungus Pleurotus ostreatus with an inhibition factor of approx. 50 %. In addition to determining the inhibition factor, the dual cultures were visually assessed at the end of the test series and divided into four inhibition classes based on Schreiner (2008). Major, moderate and mildly inhibiting types of bacteria were assigned to class I, II and III, with class III (mildly inhibiting) being the largest proportion with 44 % (class I: 12 %; class II: 22 %). The last group, class IV, represented the 22 % bacterial isolates where no inhibitory effect against the harmful fungi was recorded. Following the results of the afore mentioned tests, a range of different types of inhibiting and different types of bacteria of class I and class II was selected. Each selected strain of bacteria was individually cultivated in a liquid medium and then mixed together to form two biological solutions (mixture A and B) for the final wood preservative test series. Based on the European standards for testing the effectiveness of wood preservatives, see DIN EN 113 (1996-11) and DIN EN 152 (2011), test specimens of the wood species Pinus sylvestris (sapwood), Fagus sylvatica and Aesculus hippocastanum were treated with and without (control) bacteria solution (A and B). All wood test objects were positioned on agar plate, which was overgrown with the respective fungi mycelium of the standard test fungi Trametes versicolor (Linnaeus ex Fries), Coniophora puteana (Schumacher ex Fries) and Aureobasidium pullulans (de Bary). For this purpose, and as explained at the beginning, two mixtures of bacterial solutions (A and B) of the genera Bacillus, Pseudomonas and Stenotrophomonas were produced. The test specimens were soaked in the the respective mixutres. After cultivation, each test specimen was taken out at predefined intervals, and the mean loss of mass [%] was determined, as well as the moisture content of the test specimens. For the blue fungus A. pullulans additional evaluation criteria were considered, the degree of growth and the discoloration. The test series showed that the treated test specimens had similarly strong discoloration as the untreated test specimens. It was not possible to show any reduction in blue-staining due to the application of mixture B. The test specimens of the wood species Pinus sylvestris (sapwood), which were soaked in mixture A showed a weight loss of approx. 2.5 % after a test duration of 16 weeks. However, in the same time period, the control group with the untreated wood, which is without any bacterial mixture, showed a significant higher degradation of approx. 28 %. It was specifically noticeable that the moisture content in the wooden test specimens tremendously increased over the test period.

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