Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV): optimization of diagnostic procedures and pathogenesis studies

Halecker, Sabrina

doi:10.5282/edoc.28337

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Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV): optimization of diagnostic procedures and pathogenesis studies

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Die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) ist eine hochkontagiöse Erkrankung, die sich zunehmend über den afrikanischen und asiatischen Kontinent ausgebreitet und nun auch die europäischen Grenzen übersprungen hat. Die Hauptwirte sind kleine Wiederkäuer, jedoch gibt es eine Vielzahl von wissenschaftlichen Abhandlungen, nach denen die potentiell empfänglichen Wirtstiere erweitert werden sollten. In Bezug auf die Eradikation der Erkrankung im Jahr 2030, die seitens der FAO und OIE angestrebt wird, sind verlässliche diagnostische Methoden ebenso wie sichere Impfstoffe sowie ein besseres Verständnis zur Erkrankung erforderlich. Vor diesem Hintergrund war meine Arbeit darauf ausgerichtet, Pathogenesestudien mit verschiedenen PPR Virusisolaten durchzuführen und Diagnostiktools für eine schnelle sowie verlässliche Detektion von PPR-Viren (PPRV) im Feld zu testen und zu verbessern. Pro Gruppe wurden vier Ziegen deutscher Herkunft intranasal mit zwei verschiedenen PPRV-Isolaten infiziert. Einer dieser PPRV-Stämme (“India Isolat”; Stamm SMRV/IND/2013/V242.5/Shahjadpur) wurde ursprünglich aus Ziegen der indischen Region Shahjadpur isoliert, welche klinische Symptome zeigten, während das andere PPRV-Isolat (“UAE Isolat”; Stamm SMRV/UAE/2018/V135/Dubai) einen schweren Ausbruch mit hohen Mortalitäten in Echtgazellen (Gazelle gazella) nahe Dubai, UAE, verursachte. Das so gennannte „India Isolat“ verursachte in den Ziegen deutscher Herkunft milde Symptome, während die Ziegen, die mit dem „UAE Isolat“ infiziert wurden, schwere klinische Symptome einer PPRVInfektion (hohes Fieber, Verschlechterung des Allgemeinzustandes, muco-purulenter Nasenausfluss, wässriger Durchfall) zeigten. Alle Tiere wurden positiv auf Antikörper gegen PPRV getestet. Die Ziegen der Indien-Gruppe zeigten einen subklinischen Krankheitsverlauf, während die Ziegen der UAE Gruppe eine akute Infektion zeigten. Somit war die Probennahme von Materialien mit niedrigem und hohen Viruslasten in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Infektionsverläufen in den Ziegen möglich, was für die Auswahl des am besten geeigneten Probenmaterials für die Detektion von PPRV genutzt wurde. Es wurden unterschiedliche Probenmaterialien (EDTA-Blut, Augen-, Nasen-, Maul- und Kottupfer) auf ihren Gehalt an PPRV-Genomen getestet, die mittels PPRV-spezifischer RT-qPCR detektiert wurden. Der höchste Gehalt an Nukleinsäure des PPRV wurde in Nasentupfern gefolgt von Maultupfern detektiert, sodass beide Matrizes als geeignete Probenmaterialien für die PPRV-Diagnostik anzusehen sind. Im Weiteren wurden drei Antigennachweismethoden hinsichtlich ihrer diagnostischen Verlässlichkeit und ihrer Eignung als Pen-Side Test evaluiert. Für diesen Zweck standen ein Antigen-ELISA (ID Screen® PPR Antigen Capture) und zwei Lateral Flow Device (LFD) Systeme (ID Rapid® PPR Antigen und PESTE-Test) zur Verfügung. Erwartungsgemäß zeigten die Nasen- und Maultupfer in den drei Antigen-Testsystemen bessere Ergebnisse als die im Vergleich analysierten Kottupfer. Die beiden IDvet-Testsysteme (Antigen-ELISA und LFD-ID Rapid) schnitten in unseren Studien mit einer Sensitivität von jeweils 75,0 % für alle untersuchten Proben am besten ab. Der LFD von Lillydale (PESTE-Test) erreichte hingegen nur eine Sensitivität von 53,3 %. Aus praktischer Sicht, lieferten die LFDs Ergebnisse bereits in weniger als 30 Minuten gegenüber etwa 2 Stunden für den Antigen-ELISA. Die LFDs sind zudem sehr einfach in der Handhabung und benötigen keine weitere Laborausstattung. Eine weitere Stärke einiger LFDs ist ihre Lagerfähigkeit bei Raumtemperatur, die den diagnostischen Einsatz im Feld (besonders in afrikanischen oder asiatischen Ländern) erheblich erleichtert. In Abhängigkeit von den individuellen Anforderungen, entweder für die Routine-Diagnostik, umfangreiche Epidemiologiestudien oder für die POC-Diagnostik während eines Ausbruchgeschehens, stehen verschiedene Schnelltestsysteme für die Detektion von PPRV zur Verfügung, wovon einige in unseren Studien vergleichend getestet worden. In Bezug auf die Laborausstattung, Fähigkeiten der Anwender, Anforderungen an die diagnostische Leistungsfähigkeit (Sensitivitäten, Spezifitäten, Zeitansprüche), klinischer Verlauf der Infektion im Tier (zu erwartende geringlastige versus hochlastige Proben) und die individuellen Zielsetzungen haben die in unseren Studien validierten Tests ihren Nutzen für die Detektion von PPRV. Die hier dargelegten Ergebnisse sollen dabei als Entscheidungshilfe für den Endanwender bei der Auswahl des für ihn passenden diagnostischen Tests verstanden werden. Und das hier beschriebene Referenzproben-Panel wird dazu beitragen, zukünftige Testsysteme, wie z.B. molekulare POC-Testsysteme, zu optimieren und zu validieren.

Peste des petits ruminants (PPR) is a highly contagious disease that is increasingly spreading across the African and Asian continent and has recently crossed the European borders. Main hosts are small ruminants but there is a plenty of references according to which the potentially susceptible host species have to be expanded. Concerning the elimination of this disease up to 2030, strived by FAO and OIE, reliable diagnostic tools, improved vaccines and a better knowledge about the disease are necessary. In this context, the here reported study aimed to characterize various PPR virus (PPRV) isolates in vivo and to improve diagnostic tools detecting PPRV in a rapid and reliable way, ready-to-use in the field. Therefore, groups of four goats of German breed were intranasally infected with two distinct PPRV isolates. One PPRV strain was originally isolated from goats showing clinical signs of a mixed infection of PPRV and FMDV in the Indian region Shahjadpur (“India isolate”; strain: SMRV/IND/2013/V242.5/Shahjadpur; accession number in GenBank: MN369543). The other PPRV isolate was involved in a severe outbreak near Dubai, UAE, causing high mortalities in mountain gazelles (“UAE isolate”; strain: SMRV/UAE/2018/V135/Dubai; accession number in GenBank: MN369542). The so-called “India isolate” caused mild symptoms in our goats of German breed while the goats infected with the “UAE isolate” showed severe clinical signs of a PPRV infection (e.g. pyrexia, deterioration of the general condition, mucosal-purulent nasal discharge, watery diarrhea). All animals were tested positive for antibodies against PPRV. While the goats of the India group underwent a subclinical infection, the goats of the UAE group developed a severe acute disease. Thus, the collection of samples containing low and high viral loads depending on the course of an infection in the goats was possible, and the sample panel was used to select the most suitable sample matrices for PPRV detection. Several sample materials (EDTA blood, ocular, nasal, mouth and fecal swabs) were collected and tested for their amounts of viral RNA by a PPRV-specific RT-qPCR. The highest amounts of PPRV genomes were detected in nasal swabs followed by mouth swabs suggesting both matrices as suitable sample materials for diagnostic purposes. In addition, three antigen detection methods were evaluated regarding their diagnostic reliability and suitability for pen-side/point-of-care (POC) testing. For this purpose, we analysed one antigen ELISA (ID Screen® PPR Antigen Capture from IDvet) and two assays based on the lateral flow device (LFD) technology (ID Rapid® PPR Antigen from IDvet, and PESTE-Test from Lillydale). Generally, nasal and mouth swabs showed better results in their diagnostic performance compared to fecal samples. The antigen ELISA and the LFD-ID Rapid performed best in our studies, each with a sensitivity of 75.0 %. In contrast, the PESTE-Test achieved a sensitivity of only 53.3 %. Concerning the practical point of view, the tested LFDs delivered results within 30 minutes towards less than two hours for the antigen ELISA. The LFDs are also very simple in their handling and need no further laboratory equipment. Another strength of the ID Rapid is e.g. its storage capability at room temperature that considerably simplifies its diagnostic use in the field (especially in African or Asian countries). Depending on the individual requirements, either for routine diagnostics, comprehensive epidemiology studies or for POC diagnostics during an outbreak, different rapid test systems are available for the detection of PPRV, some of which have been tested comparatively in our studies. In terms of laboratory equipment, user skills, diagnostic performance requirements (sensitivities, specificities, time requirements), clinical course of infection in the animal (expected low-load versus high load samples), and individual objectives, the tests validated in our study have their value for the detection of PPRV. Nevertheless, the results presented here should be mainly understood as decision support for the end user in choosing the appropriate diagnostic test. And the reference sample panel described in my study will help to optimize and validate future test systems, such as molecular POC test systems.