Characterization of Puumala Orthohantavirus - Host Interactions: From the Field to the Bench

Orthohantaviren sind Nagetier-assoziierte Viren, die weltweit verbreitet sind und in ihrem Reservoirwirt keine symptomatische Erkrankung hervorrufen. Puumala-Orthohantavirus (PUUV) verursacht in Europa die meisten Hantavirus-Erkrankungen und wird von der Rötelmaus (Clethrionomys glareolus) übertragen. Das Genom von Hantaviren ist in drei Segmente gegliedert: das große (L) Segment (kodiert die RNA-abhängige RNA Polymerase (RdRP)), das mittlere (M) Segment (kodiert die Glykoproteine), und das kleine (S) Segment. Das S Segment enthält zwei überlappende offene Leserahmen (ORF). Diese exprimieren ein Nukleokapsidprotein (N) und ein Nicht-Struktur (NSs) Protein, einen potentiellen Typ I-Interferon (IFN-I)-Antagonisten. Bis heute ist über die Pathogenese und Anpassung von Hantaviren an ihren Wirt nur wenig bekannt, was auch daran liegt, dass es keine adäquaten Zellkultur- oder Tiermodelle gibt. Im Gegensatz zu den genannten früheren Daten zeigten die Untersuchungen von Rötelmäusen aus dem Frühling und Sommer 2019 in dieser Arbeit eine hohe Abundanz an Rötelmäusen und PUUV Prävalenz in Rötelmäusen, sowie eine hohe humane Inzidenz in manchen Endemiegebieten Deutschlands, wohingegen diese Werte in anderen Endemieregionen niedrig waren. Regionale und lokale Gesundheitsämter müssen über das heterogen verteilte Gesundheitsrisiko für die Bevölkerung informiert werden. Zum besseren Verständnis von Virus-Wirt-Interaktionen wurden in dieser Arbeit neue Zelllinien von Rötel- und Feldmäusen etabliert und auf ihre Suszeptibilität und Replikationsfähigkeit für verschiedene zoonotische und nicht-zoonotische Viren getestet. Der PUUV-Stamm Vranica/Hällnäs replizierte sehr effektiv in nur einer der neuen Rötelmauszelllinien der Niere, aber nicht in den anderen vier untersuchten Rötelmaus- und Feldmauszelllinien. Tula-Orthohantavirus (TULV) hingegen replizierte in Nierenzellen der Feldmaus, aber war in den anderen Zelllinien von Rötel- und Feldmaus stark eingeschränkt. Einige Viren, darunter Kuhpockenvirus, Vaccinia-Virus, Rifttal Fieber-Virus und Enzephalomyokarditis-Virus 1, zeigten in allen Zelllinien eine effektive Replikation, wohingegen sich West Nil-Virus, Usutu-Virus, Sindbis-Virus und Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus nur in einem Teil der Zelllinien vermehren ließen. Diese Ergebnisse lassen einen Spezies- und Gewebe-spezifischen Tropismus für viele der untersuchten Viren vermuten und zeigen, die Bedeutung der Wühlmaus-Zelllinien für zukünftige detaillierte Untersuchungen zu diesen Fragen. Mit Hilfe einer der neuen Rötelmauszelllinien, konnten die ersten deutschen PUUV-Isolate aus Rötelmäusen isoliert werden, die in der Hochendemieregion um Osnabrück gefangen worden sind. Mit Hilfe einer Target-Enrichment-vermittelten High-Throughput-Sequencing-Technologie wurden PUUV-Komplettgenome für das zugrundeliegende Originalmaterial der Lunge, nach der Isolation und nach Passagieren in VeroE6-Zellen und Rötelmaus-Nierenzellen bestimmt und miteinander verglichen. Hier wurden einzelne Aminosäureaustausche in der RdRP nach Anzucht bei beiden stabilen Isolaten beobachtet. Ein Isolat aus VeroE6-Zellen, zeigte nach weiteren Passagen auf Rötelmauszellen einen niedrigeren Titer als nach Passage auf VeroE6-Zellen. Außerdem wurden mit Hilfe von virusähnlichen Partikeln, basierend auf der Sequenz für den Glykoprotein-Vorläufer (GPC) eines deutschen PUUV-Stammes aus der gleichen Region, monoklonale Antikörper hergestellt, die mit den neuen Isolaten reagierten. Zur Analyse des NSs-Proteins von PUUV und anderen Hantaviren wurde zunächst im Rahmen einer Feldstudie die Evolution von NSs- und N-kodierenden Sequenzen des PUUV aus Rötelmäusen untersucht und die NSs-Sequenzen durch in vitro-Studien auf ihren inhibitorischen Einfluss auf den IFN-β Promoter untersucht. Die Analyse von Blut- und Lungenproben von 851 in Baden-Württemberg und Nordrhein-Westfalen in den Jahren 2010-2014 gefangenen Rötelmäusen, zeigte 27.8% positive Rötelmäuse für PUUV-spezifische Antikörper und 22.3% positive Tiere für PUUV-RNA. In den Hantavirus-Ausbruchsjahren 2010 und 2012 war die PUUV-Prävalenz in Rötelmäusen höher als 2011, 2013 und 2014. S-Segment-Sequenzen von allen positiven Tieren zeigten Aminosäure- und DNA-Sequenztypen des NSs-offenen Leserahmens (ORF), die zeitlich und örtlich variierten, wohingegen der N-ORF hoch konserviert war. Ein Sequenztyp pro Fangort dominierte über die gesamte Beobachtungsperiode. Der NSs-ORF unterschied sich stark zwischen PUUV-Stämmen in den regionalen Rötelmauspopulationen im Ausbruchsjahr 2012. Mittels molekularbiologischer Analysen rekombinanter NSs-Proteine, wurden Expressionsprodukte von drei internen Initiationskodons im NSs identifiziert. Mittels Luziferase-Reporter-Assay wurde die Inhibition von IFN-I durch NSs-Proteine verschiedener Hantaviren bestimmt. PUUV, TULV, Prospect Hill- und Khabarovsk-Orthohantavirus NSs inhibierten die IFN-I-Induktion um bis zu 70%. Sin Nombre- und Andes-Orthohantavirus-NSs Proteine zeigten dagegen einen geringeren Effekt im Vergleich zu den anderen NSs Proteinen. Die 20 N-terminalen Aminosäuren des PUUV-NSs-Proteins stellten sich als besonders wichtig für die Hemmung des IFN-I-Promoters heraus. Zusammenfassend sind die hier neu eingeführten Zelllinien, Antikörper, Reporter-Assays und PUUV-Isolate wertvolle neue Werkzeuge für die zukünftige Hantavirusforschung. Der Nachweis der Aktivität des NSs-Proteins von PUUV in humanen Zellen trägt zum Verständnis der Virus-Wirt-Interaktionen im Fehlwirt Mensch bei und unterstreicht die Notwendigkeit zukünftiger Studien in einem Rötelmaussystem. Die Surveillancestudien zeigten die Notwendigkeit der zeitnahen Weitergabe von Informationen zum potentiellen Infektionsrisiko der Bevölkerung in Endemiegebieten zur Einleitung geeigneter Gegenmaßnahmen.