Genetic characterisation of highly pathogenic avian influenza viruses based on novel real-time nanopore sequencing

King, Jacqueline GND

The constant evolution and pandemic potential of influenza A viruses (IAV) makes them one of the most complex and precarious viral pathogens globally. Alongside the impact on animal health and the livestock industry, some strains can carry zoonotic potential with extensive public health consequences. Classified depending on the host of origin, IAV are termed avian influenza viruses (AIV), swine influenza A viruses (swIAV), or otherwise in line with the host. Additionally, AIV are further divided into highly pathogenic AIV (HPAIV) or low pathogenic AIV (LPAIV) according to their level of pathogenicity. Characteristic for IAV is the extraordinary rate of evolution and rapid adaptation to host or environmental changes by point mutations, segment reassortment or, in rare cases, ribonucleic acid (RNA) recombination. This results in the unceasing risk of newly emerging and potentially zoonotic IAV strains, making rapid and continuous surveillance with full genomic evaluation of IAV indispensable. This thesis presents the development and validation of a rapid, multiplex and portable third-generation nanopore sequencing protocol for whole-genome sequencing (WGS) of IAV. In comparison to large, expensive and laborious second-generation sequencers, the proposed nanopore workflow allows a great reduction in time and cost by utilising the “size-of-a-chocolate-bar” MinION sequencer (Oxford Nanopore Technologies) with multiplexing and rapid, transposase-based library preparation. Only full genome characterisation can permit detailed understanding of outbreak dynamics and molecular epidemiology while aiding in rapid outbreak response and the establishment of appropriate prevention strategies. Since the emergence of the goose/Guangdong (gs/GD) lineage in 1996, specifically gs/GD clade 2.3.4.4 HPAI H5 viruses have shown an unprecedented tendency for reassortment and high mortality among the wild bird population and poultry industry. Here, the application of WGS is of utmost importance to identify new reassortants in a timely manner. After the first introduction of clade 2.3.4.4b HPAI H5 viruses to Germany in 2016, three subtypes (H5N8, H5N5 and H5N6) carrying seven reassortants (Ger11-16, Ger-12-16.1 and Ger-12-16.2, Ger-12-16-N5.1 and Ger-12-16-N5.2, Ger-12-17-N6, and Ger-01- 20) have been identified by WGS to date. The work collected in this thesis presents studies on the outbreak dynamics of the major 2016/2017 HPAIV epidemic and the most recent HPAIV H5N8 outbreak in 2020. Further, the zoonotic propensity of the circulating H5N6 and H5N5 strains was evaluated and genetically analysed, proving to carry very low zoonotic potential. The most recent incursion of a reassorted clade 2.3.4.4b HPAI H5N8 virus (Ger-01-20) to Germany was genetically characterised by the previously described third-generation nanopore sequencing protocol to achieve rapid whole genome and reassortment evaluation, allowing the categorisation into clade 2.3.4.4b and reassortment dissection. Likewise achieved by WGS, this thesis includes the detection of a novel HPAIV H5N2 strain in Egypt. Although the previously circulating HPAIV H5N1 and LPAIV H9N2 strains appeared genotypically stable, the introduction of clade 2.3.4.4b HPAI H5N8 viruses to Egypt in 2016 resulted in the emergence of multiple novel reassorted HPAIV. Due to the endemic situation in Egypt and zoonotic propensity of particular strains, active surveillance and rapid detection is of utmost importance to aid in prevention. IAV will continue to evolve, mutate and reassort in the future. The role of easy and swift WGS for IAV surveillance, especially frequently reassorting strains like clade 2.3.4.4b, is indispensable. This thesis encompasses a novel IAV third-generation nanopore sequencing workflow to aid in rapid full genome evaluation, in-depth genetic analysis of previous clade 2.3.4.4b outbreaks in Germany allowing molecular epidemiology studies and insights into outbreak dynamics, and the novel detection of reassortment of circulating AIV strains in Egypt. The findings of this thesis can help with imminent outbreaks and the essential surveillance of IAV, potentially curbing future epidemics or even pandemics.

Die ständige Weiterentwicklung und das pandemische Potenzial von Influenza A Viren (IAV) machen sie zu einem der komplexesten und gefährlichsten viralen Erreger weltweit. Neben den Auswirkungen auf die Tiergesundheit und die Tierhaltung können einige Stämme ein zoonotisches Potenzial mit weitreichenden Folgen für die öffentliche Gesundheit haben. Je nach Herkunftswirt werden die IAV als aviäre influenza/Vogelgrippe Viren (AIV), Schweinegrippe Viren (swIAV) oder in anderer Weise entsprechend dem Wirt klassifiziert. Darüber hinaus werden AIV je nach Grad ihrer Pathogenität in hochpathogene AIV (HPAIV) oder niedrigpathogene AIV (LPAIV) eingeteilt. Charakteristisch für IAV ist die hohe Evolutionsrate und schnelle Anpassung an Wirts- oder Umweltveränderungen durch Punktmutationen, Segment-Reassortierung oder, in seltenen Fällen, Ribonukleinsäure (RNA)- Rekombination. Daraus ergibt sich das bestehende Risiko neu auftretender und potenziell zoonotischer IAV-Stämme, was eine schnelle und kontinuierliche Überwachung mit am besten vollständiger genomischer Erfassung und Auswertung der IAV unabdingbar macht. In dieser Arbeit wird die Entwicklung und Validierung eines schnellen und mobilen NanoporenSequenzierungsprotokolls für die Vollgenomsequenzierung der IAV vorgestellt. Im Vergleich zu großen, teuren und arbeitsintensiven Sequenziergeräten der zweiten Generation ermöglicht der vorgeschlagene Nanopore-Workflow durch den Einsatz des etwa 100 Gramm leichten MinIONSequenzers (Oxford Nanopore Technologies, ONT) mit Multiplexing und schneller, Transposasenbasierter Sequenzierbibliothek-Vorbereitung eine große Zeit- und Kostenersparnis. Nur eine vollständige Genomcharakterisierung kann ein detailliertes Verständnis der Ausbruchsdynamik und der molekularen Epidemiologie ermöglichen und gleichzeitig zu einer schnellen Reaktion auf Ausbrüche und zur Etablierung geeigneter Präventionsstrategien beitragen. Seit dem Aufkommen der Goose/Guangdong (gs/GD) Linie im Jahr 1996 haben insbesondere HPAI H5 Viren der gs/GD Klade 2.3.4.4 eine hohe Reassortierungstendenz einhergehend mit einer hohen Sterblichkeit in der Wildvogelpopulation und der Geflügelindustrie gezeigt. Hier ist die Anwendung von Vollgenomsequenzierung von größter Bedeutung, um neue Reassortierungen rechtzeitig zu identifizieren. Nach der ersten Einschleppung von HPAI H5 Viren der Klade 2.3.4.4b nach Deutschland im Jahr 2016 wurden durch Vollgenomsequenzierung bisher drei Subtypen (H5N8, H5N5 und H5N6) mit insgesamt sieben Reassortanten (Ger-11-16, Ger-12-16.1 und Ger-12-16.2, Ger-12-16-N5.1 und Ger-12-16-N5.2, Ger-12-17-N6 und Ger-01-20) identifiziert. Diese Promotionsarbeit stellt Studien zur Ausbruchsdynamik der großen HPAIV Epidemie 2016/2017 vor. Darüber hinaus wurde das zoonotische Potenzial der zirkulierenden H5N6- und H5N5-Stämme bewertet und genetisch analysiert, wobei sich herausstellte, dass sie ein sehr geringes zoonotisches Potenzial besitzen. Die jüngste Einschleppung eines neu reasortierten HPAI H5N8 Virus der Klade 2.3.4.4b (Ger-01-20) nach Deutschland wurde genetisch durch das zuvor beschriebene Nanoporen-Sequenzierungsprotokoll charakterisiert, um eine rasche Bewertung des Gesamtgenoms und der Reassortierung zu erreichen. Auch ein neuartiger HPAIV H5N2-Stamm aus Ägypten konnte mit Hilfe dieser in der Arbeit beschriebenen Technik vollständig genetisch charakterisiert werden. Obwohl die zuvor zirkulierenden HPAIV H5N1- und LPAIV H9N2-Stämme genotypisch stabil zu sein schienen, führte die Einführung von HPAI H5N8 Viren der Klade 2.3.4.4b nach Ägypten im Jahr 2016 zur Entstehung mehrerer neuartiger reassortierter HPAIV. Aufgrund der endemischen Situation in Ägypten und der zoonotischen Neigung bestimmter Stämme ist eine aktive Überwachung und schnelle Erkennung für die Prävention von größter Bedeutung. IAV werden sich auch in Zukunft weiterentwickeln, mutieren und reassortieren. Die Rolle der Vollgenomsequenzierung bei der Überwachung von IAV, insbesondere bei der häufigen Reassortierung von Stämmen aus der Klade 2.3.4.4b, ist unverzichtbar. Diese Arbeit umfasst einen neuen IAV-Arbeitsablauf zur Nanoporen-Sequenzierung der dritten Generation, der eine schnelle und vollständige Genomauswertung sowie eine eingehende genetische Analyse früherer und laufender Ausbrüche, z.B. der Klade 2.3.4.4b in Deutschland, erlaubt. Damit werden in der Folge dann auch retrospektive oder sehr zeitnahe molekular-epidemiologische Studien zur Ausbruchsdynamik möglich. Die gleiche Methodik hat schließlich auch zum Nachweis einer neuen HPAIV-H5-Reassortante in Ägypten geführt. Insgesamt könnten die Ergebnisse dieser Arbeit bei bevorstehenden Ausbrüchen und der unerlässlichen Überwachung der IAV helfen, wodurch künftige Epidemien oder sogar Pandemien möglicherweise besser erkannt und kontrolliert werden können.

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King, Jacqueline: Genetic characterisation of highly pathogenic avian influenza viruses based on novel real-time nanopore sequencing. München 2021. Ludwig-Maximilians-Universität München, Tierärztliche Fakultät.

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