Biodiversität im Wirt-Pathogen-System Apfel/ Apfelmehltau (Malus spp./ Podosphaera leucotricha (Ell. & Ev.) E.S. Salmon) : Variabilität des Apfelmehltaus auf molekularer Ebene, in der Virulenz auf Malus-Genotypen mit pyramidisierten Resistenzen sowie in Cytochrom b-bedingter Strobilurinresistenz

Lesemann, Silke GND

Das Ziel dieser Arbeit war es, relevante Informationen über die Variabilität des Apfelmehltau zu erlangen, um diese in der Resistenzzüchtung beim Apfel zu nutzen. Dabei wurde zum einen die Virulenz einer Auswahl von Isolaten auf einem Malus-Sortiment getestet, zum anderen wurden Proben des Pathogens auf molekularer Ebene mit Markern untersucht, um die genetische Variabilität festzustellen. Ein dritter Teil der Arbeit befasste sich mit der Untersuchung, ob die in anderen Pathogenen auftretende Strobilurin-Fungizid-Resistenz (G143A), die auf einer Mutation im Pathogen beruht, auch beim Apfelmehltau auftritt. Zwölf Isolate von Podosphaera leucotricha wurden auf einem Sortiment von 41 Malus-Genotypen getestet. Anfällige Kontrollsorten wurden in erster Linie mit Genoytpen verglichen, die die beschriebenen Mehltauresistenzen tragen, desweiteren mit Wildarten und Sorten, die als resistent oder gering anfällig gelten. Bei den Testungen hat sich gezeigt, dass alle zwölf Mehltau-Isolate sich in ihrer Virulenz unterscheiden. Somit erscheint die Variabilität als sehr hoch. Auch Isolate, die aus einer Knospe stammten, waren deutlich unterschiedlich. Auf der Pflanzenseite haben die Versuche gezeigt, dass die beschriebenen Resistenzen in D12 (Pld), MIS (Plmis) und 'White Angel' (Plw) gegenüber den getesteten Isolaten voll wirksam waren, es konnten keine Infektionen stattfinden. Anders sah die Situation bei den Resistenzen aus M. x robusta (Pl1) und M. zumi (Pl2) aus. Die Referenzgenotypen für diese Resistenzen (A142/5 und M. zumi 274) konnten von fast allen Isolaten infiziert werden, die Resistenzen wurden deutlich überwunden. Auch in der Literatur wurde berichtet, dass schon im Feld virulente Isolate auf Pl1- und Pl2-Genotypen auftraten. Neben den Referenzgenotypen wurden Nachkommen einer Kreuzung zwischen einem Pl1- und einem Pl2-Träger getestet, die die Gene teilweise in Kombination tragen. Es hat sich gezeigt, dass diese deutlich unterschiedlich zu den Referenzgenotypen reagierten: Genoytpen mit den einzelnen Genen zeigten zwar Befall, waren aber weniger anfällig als die Referenzen. Die Genotypen, die beide Gene in Kombination trugen, waren weitgehend resistent. Die Ergebnisse machen wahrscheinlich, dass die Pl1- und Pl2-Resistenzen nicht monogen bedingt sind, sondern durch mehrere Gene in Interaktion wirken. Das Pyramidisieren von Resistenzgenen scheint eine wirksame Methode zu sein, um Pflanzen vor virulenten Isolaten zu schützen, selbst wenn die einzelnen Resistenzgene bereits wirkungslos geworden sind. Dabei scheinen additive Effekte der verschiedenen Gene zusätzlichen Schutz zu bieten. Es wurden molekulare AFLP-Marker entwickelt, mit denen eine Sammlung von 27 Isolaten aus Europa, China und Indien untersucht werden konnte. Der auf den Markerdaten basierende Stammbaum unterteilt die Isolate in zwei getrennte Hauptgruppen, wobei keine offensichtliche Korrelation zu Herkunft, Primär- oder Sekundärbefall oder dem Grad der Aggressivität der Isolate erkennbar war. Wodurch die Unterteilung in diese zwei Gruppen bedingt ist, ist unklar. Auffällig war, dass die Isolate in Gruppe 1 sehr viel mehr Homogenität aufwiesen als die der Gruppe 2. Auch Feldproben von verschiedenen Standorten in Europa, China und Indien, die mit RAPD- und SCAR-Markern untersucht wurden, wiesen die Aufteilung der Proben in zwei getrennte Gruppen auf, dabei war Gruppe 2 in diesem Fall in zwei deutliche Untergruppen unterteilt, deren eine (2-2) nur Feldproben und keins der Isolate enthielt. Ähnlichkeiten dieser Ergebnisse mit Erkenntnissen über den Rebenmehltau wurden diskutiert. Hinsichtlich der Fungizidresistenz war es das Ziel dieser Arbeit herauszufinden, ob eine Mutation im Cytochrom b-Gen von P. leucotricha zu Resistenz gegenüber Strobilurin-Fungiziden führt, wie es bei anderen Pflanzenpathogenen beobachtet wurde. Die Untersuchungen auf molekularer Ebene zeigten eine hohe Variabilität in der betreffenden Region des Genes. Alle getesteten Isolate waren heteroplasmatisch für die G143A-Mutation. Dies galt sowohl für Isolate die erst kürzlich von Strobilurin-behandelten Bäumen gewonnen wurden, als auch für solche, die bereits mehrere Jahre ohne Fungizide in Kultur gehalten worden waren. Der Anteil von resistenten und Wildtyp-Formen innerhalb eines Isolates variierte zwischen verschiedenen Isolaten, unabhängig von ihrer Herkunft. Sensitivitätstests und Keimtests mit Trifloxystrobin für drei Isolate zeigte auch Unterschiede in der Reaktion der Isolate gegenüber dem Fungizid. Ein Isolat war fähig, unter sehr viel höheren Konzentrationen des Fungizides zu wachsen als die beiden anderen. Bei einer Konzentration, die 10-fach höher war als die empfohlene Feldkonzentration, konnte immer noch 18% Keimung beobachtet werden. Aufgrund der hier gewonnen Daten scheint die G143A-Mutation im Apfelmehltau weit verbreitet zu sein, jedoch möglicherweise unabhängig von der Anwendung von Strobilurin-Fungiziden. In der Regel führt erst eine häufige Awendung von Fungiziden zu der Entwicklung oder Selektion von resistenten Formen. Um eine Selektion besonders resistenter Formen zu vermeiden, sollten die Richtlinien zur Anwendung der Strobilurine streng eingehalten werden, d.h. Einsatz der Mittel nur in Kombination mit Kontaktfungiziden und eine Vermeidung wiederholter Anwendungen.

The objective of this work was to gain new information about the variability of apple powdery mildew relevant for their usage in apple resistance breeding. A selection of isolates has been tested for their virulence on a collection of Malus-genotypes and greater numbers of samples of the pathogen have been screened with molecular markers for their variability. A third part of this work was concentrated on the question whether the strobilurin-fungicide-resistance G143A, which can be found in other pathogens, is also present in apple powdery mildew. Twelve isolates of Podosphaera leucotricha have been tested on a collection of 41 Malus genotypes. The collection included, besides susceptible controls, mostly genoytpes which are known to carry well described mildew resistance genes but also wild species and cultivars which are considered to be resistant or moderately susceptible. The tests have shown that all isolates differ in their virulence and thus proved the variability to be quite high. Also isolates differed clearly although they originated from a single bud. On the plant side the experiments have confirmed the effectiveness of the known resistances in the genotypes D12 (Pld), MIS (Plmis) and 'White Angel' (Plw). No infection has been observed on these genotypes with the tested isolates. The results for the resistances from M. x robusta (Pl1) and M. zumi (Pl2) were different. The reference genotypes for these major resistances (A142/5 and M. zumi 274) could be infected by most of the isolates, the resistances were clearly overcome. Similar findings of virulent isolates on Pl1- and Pl2-genotypes in the field have been published. Apart from the reference genotypes also progeny of a cross between Pl1- and Pl2-genotypes have been tested, which partly carry the resistance genes in combination. The results showed that these plants reacted differently than the reference genotypes: plants with the single genes also showed infection but were less susceptible. Genoytpes which carried the two genes in combination were in contrast mainly resistant. These results suggest that the Pl1- and Pl2-resistances are probably not monogenic but the result of several interacting genes. Pyramiding of resistances appears to be an effective method to protect plants from virulent isolates even if the single resistances have been overcome. Possibly additive effects from the different genes offer the additional protection against the pathogen. Molecular AFLP-markers have been developed and applied on a collection of 27 isolates from Europe, China and India. Pedigrees have been produced based on the marker data which separate the isolates into two distinct groups. There has been no clear correlation between origin of the isolates, primary or secondary infection type or degree of aggressiveness. It is unclear by what the determination into the two groups is caused. It was noticeable that isolates in group 1 showed much more homogeneity than isolates in group 2. Moreover, field samples from different locations in Europe, China and India have been analysed with RAPD- and SCAR-markers and showed the same division into two separate groups, of which group 2 appeared subdivided into two subgroups. Subgroup 2-2 included only field samples and no isolates. Similarities between these results and findings for grape powdery mildew have been discussed. Regarding the fungicide resistance the objective of this work was to find out whether a mutation in the mitochondrial cytochrome b-gene of P. leucotricha leads to resistance against strobilurin fungicides, as has been shown for other pathogens. Molecular analyses showed a high variability in the corresponding region of the gene. All isolates tested were heteroplasmatic for the G143A-mutation. This has been shown both for isolates sampled from trees recently treated with strobilurin fungicides and for isolates which have been cultivated without fungicide contact for several years. The proportion of resistant and wildtype forms within a single isolate varied between the isolates regardless to their origin. Sensitivity tests and germination tests with three isolates also showed differences in the reaction to the fungicide. One isolate has been able to grow under much higher fungicide concentrations than the two others. At a concentration ten times higher than the recommended field concentration still 18% of the spores were able to germinate. The results suggest that the G143A-mutation is prevalent in apple powdery mildew but maybe independent from a previous application of strobilurin fungicides. Normally the frequent application of fungicides leads to development or selection of resistant forms of the pathogens. To prevent the selection of highly resistant strains the guidelines for fungicide application should be followed strictly: strobilurins should be used only in combination with contact fungicides and repeated application should be avoided.

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Lesemann, Silke: Biodiversität im Wirt-Pathogen-System Apfel/ Apfelmehltau (Malus spp./ Podosphaera leucotricha (Ell. & Ev.) E.S. Salmon). Variabilität des Apfelmehltaus auf molekularer Ebene, in der Virulenz auf Malus-Genotypen mit pyramidisierten Resistenzen sowie in Cytochrom b-bedingter Strobilurinresistenz. Halle‐Wittenberg 2011. Julius Kühn-Institut.

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