Adaptation and diversification of bacterial communities to pesticide contaminants in on-farm biopurification systems via mobile genetic elements
Bacteria play important ecological roles and through biodegradation processes, using the pollutants as carbon source to survive, they are fundamental in "cleaning" environments contaminated by anthropogenic activities. We assumed that the main pathways for bacterial adaptation to new contaminants are catabolic genes carried often on plasmids such as IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmids. To identify "hot spot" environments containing bacterial communities carrying these catabolic plasmids the first step was to understand and predict plasmid dissemination and their functions. A screening of different environments revealed that biopurification systems (BPS), used for the treatment of pesticide contaminated waste water at farms through biodegradation and sorption processes, were "hot spots" of plasmids potentially carrying catabolic genes as high abundances of IncP-1, IncP-7 and IncP-9 plasmids were detected. A suite of different molecular biology tools such as PCR-Southern blot hybridization based detection, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), clone library and pyrosequencing were applied to analyze total community (TC) DNA or plasmid DNA aiming to unravel the response of bacterial communities to pesticides and to reveal how the degree of pollution influences the abundance and diversity of mobile genetic elements (MGEs) such as plasmids. In order to investigate the influence of high pesticide concentrations on the relative abundance of specific bacterial populations and plasmids likely carrying degradative genes, a microcosm with BPS material spiked with linuron or not was established and monitored over the time. Moreover, for the first time the effects of different pesticides on the abundance and diversity of MGEs and shifts of bacterial communities in an on-farm BPS were investigated over an entire agricultural season. Interesting results were obtained. An increase in pesticide contamination in BPS was associated with an increase of abundance and fluctuations in the diversity of MGEs specifically of IncP-1 plasmids, very "promiscuous" broad-host-range (BHR) often carrying catabolic genes. Through exogenous plasmid isolation, a cultivation-independent technique, several of IncP-1 and IncP-9 plasmids were captured from BPS into Pseudomonas putida recipient cells, allowing a deeper plasmid analysis by sequencing (still in progress). The 16S rRNA gene-based analyses revealed that particular bacterial groups in BPS are responding to pesticides contamination, such as Betaproteobacteria which increased in abundance, while other groups such as Firmicutes and Bacteriodetes had a selective disadvantage in such a polluted environment. Through the methodologies applied in the present work, the dynamics and plasticity of bacterial communities of BPS in response to pesticide exposure was revealed and taxa and plasmids potentially involved in the biodegradation process were identified.
Bakterien spielen eine bedeutende Rolle in der Ökologie indem sie Schadstoffe abbauen, die sie als Kohlenstoffquelle zum Überleben nutzen, leisten sie einen wesentlichen Beitrag bei der ‚Reinigung’ von Gebieten, die durch Einwirkung des Menschen mit Schadstoffen belastet sind. Wir gingen davon aus, dass die Anpassung der Bakterien an neuartige Schadstoffe vor allem über katabolische Gene stattfindet, die sich oft auf Plasmiden wie IncP-1, IncP-7 und IncP-9 befinden. Um sogenannte ‘hot spots’ von Bakteriengemeinschaften, die diese katabolischen Plasmide beherbergen, erkennen zu können, bestand der erste Schritt darin, die Verbreitung der Plasmide zu verstehen und vorherzusagen. Ein Screening verschiedener Umwelthabitate zeigte, dass u.a. Bioreinigungssysteme, die auf landwirtschaftlichen Höfen für die Reinigung von Pestizid-belasteten Abwässern durch biologischen Abbau und Absorption eingesetzt werden, ‚hot spots‘ von Plasmiden mit katabolischen Genen sind, da IncP-1, IncP-7 und IncP-9 Plasmiden in hoher Abundanz nachgewiesen wurden. Eine Reihe von molekularbiologischen Methoden – Detektion durch PCR Southern Blot-Hybridisierung, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE), Klonierung-Sequenzierung oder Pyrosequenzierung von Amplikons (16S rRNA-Genfragmente, trfA) wurden genutzt, um DNA aus der Gesamtgemeinschaft oder Plasmid-DNA zu analysieren und so die Antwort der Bakteriengemeinschaften auf Pestizide zu charakterisieren und dahinterzukommen, wie sich das Ausmaß der Verunreinigung auf die Verbreitung und Diversität mobiler genetischer Elemente (MGE) wie Plasmide auswirkt. Um den Einfluss hoher Pestizid-Konzentrationen auf die relative Abundanz von spezifischen bakteriellen Populationen und Plasmiden, die vermutlich Abbau-Gene tragen, zu erforschen, wurde ein Mikrokosmos mit Material aus einem Bioreinigungssystem – mit und ohne Linuron – etabliert und zu drei Zeitpunkten analysiert. Darüber hinaus wurden erstmalig während einer vollen landwirtschaftlichen Saison die Auswirkungen verschiedener Pestizide auf die Verbreitung und Diversität von MGE und Veränderungen der Bakteriengemeinschaften in einem farmeigenen Bioreinigungssystem untersucht und interessante Ergebnisse gewonnen. Ein Anstieg in der Pestizid-Exposition im Bioreinigungssystem ging einher mit einer größeren Abundanz und größeren Fluktuationen in der Diversität von MGE, vor allem von IncP-1 Plasmiden, die durch einen weiten Wirtsbereich charakterisiert sind und die häufig katabolische Genen tragen. Mit Hilfe der exogenen Plasmid-Isolierung, einer kultivierungsunabhängigen Technik, wurden mehrere IncP-1 und IncP-9 Plasmide aus dem Bioreinigungssystem in Pseudomonas putida-Rezeptor-Zellen überführt, wodurch eine genauere Plasmid-Analyse durch Sequenzierung ermöglicht wird (Auswertung ist noch nicht abgeschlossen). Die auf dem 16S rRNA-Gen basierenden Analysen machten deutlich, dass bestimmte Bakteriengruppen im Bioreinigungssystem auf eine Verunreinigung mit Pestiziden reagieren, so nahm die Abundanz der Betaproteobacteria und der Gammaproteobacteria zu, während andere Gruppen, z.B. Firmicutes und Bacteriodetes, in einem derartig verunreinigten Umfeld einen selektiven Nachteil hatten. Durch den genutzten polyphasischen Ansatz konnte in dieser Arbeit die Dynamik und Plastizität von bakteriellen Gemeinschaften in Bioreinigungssystem bei Pestizid-Exposition gezeigt werden und mögliche am Abbau beteiligte Taxa und Plasmide identifiziert werden.
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