Herpesvirus Nuclear Egress and the Analysis of Involved Viral and Cellular Key Players

Hölper, Julia E. GND

Herpesviruses are enveloped DNA viruses which are dependent on two fusion steps for efficient replication in the host cell. First, they have to fuse their envelope with the cellular plasma membrane or with the vesicle membrane after endocytic uptake to enter the host cell and second, they have to export the newly generated nucleocapsids from the site of assembly to the cytoplasm by fusion of the primary virion envelope with the outer nuclear membrane (ONM). The main goal of this project was to provide a better understanding of how herpesvirus capsids exit the nucleus. On the one hand this thesis aimed at finding cellular proteins involved in nuclear egress (Paper I), while on the other the focus was on further characterization of the viral nuclear egress complex (NEC, Paper II) and its interaction with the capsid (Paper III). It is the hallmark of viruses, including herpesviruses, to hijack host cell proteins for their efficient replication. Some of those interactions are well characterized, while others might not yet have been discovered. In the last step of the nuclear egress, where the primary virion membrane fuses with the ONM, most likely a cellular machinery is involved. The presented work focused on Torsin, the only known AAA+ ATPase localizing in the endoplasmic reticulum and the perinuclear space (PNS). For this, the effect of overexpression of WT and mutant proteins, as well as CRISPR/Cas9 generated knock-out cell lines, on PrV replication was analyzed. Neither single overexpression nor single knockouts of TorA or TorB had any significant effects on virus titers. However, infection of TorA/B double knockout cells revealed reduced viral titers and an accumulation of primary virions in the PNS at early infection times, indicating a delay in nuclear egress. The process of nuclear egress has been intensively investigated without revealing all its details. To address some of the missing aspects we generated monoclonal antibodies (mAbs) against the NEC and its components (pUL31 and pUL34) for a better visualization of the process in transfected as well as infected cells. These mAbs provide a useful tool for future analyses. The publication of the NEC crystal structure formed the basis for intensive research on the molecular details of the NEC formation and its interaction with the nucleocapsid. Recently, our lab showed that lysine (K) at position 242 in the membrane-distal part of pUL31 is crucial for incorporation of the nucleocapsid into budding vesicles. Replacing K by alanine (A) resulted in accumulations of vesicles in the PNS, while mature capsids were not incorporated. To test whether this is due to electrostatic interference or structural restrictions we substituted K242 by different aa to determine the requirements for nucleocapsid uptake into the nascent primary particles. To analyze whether the defect of pUL31-K242A can be compensated by second-site mutations, PrV-UL31-K242A was passaged and mutations in revertants were analyzed. Different mutations have been identified compensating for the K242A defect. A considerable number of mutations indicates that the NEC is much more flexible than previously thought. Further, we gained information that the K at position 242 is not directly involved in capsid interaction, while it is more likely involved in rearrangements within the NEC coat.

Herpesviren sind umhüllte DNA-Viren, die zur effizienten Replikation in der Wirtszelle auf zwei Fusionsmechanismen angewiesen sind. Erstens müssen sie ihre Hülle entweder mit der zellulären Plasmamembran oder der Vesikelmembran nach erfolgter Endozytose verschmelzen, um in die Wirtszelle einzudringen. Zweitens müssen die neu gebildeten Nukleokapside aus dem Zellkern durch Fusion der primären Virushülle mit der äußeren Kernmembran in das Zytoplasma exportiert werden. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, den herpesviralen Kernaustritt, auch "Nuclear Egress" genannt, besser zu verstehen. Zum einen zielte die Arbeit auf eine Identifizierung von zellulären Proteinen, die beim Nuclear Egress eine Rolle spielen, ab (Publikation I). Zum anderen sollte der für den Kernaustritt wichtige Nuclear Egress Complex (NEC) genauer charakterisiert (Publikation II) und die Interaktion mit dem Kapsid entschlüsselt werden (Publikation III). Herpesviren nutzen für ihre effiziente Replikation Proteine der Wirtszelle nutzen. Einige dieser Interaktionen wurden in der Vergangenheit bereits gut charakterisiert, während andere möglicherweise noch nicht entdeckt wurden. Im letzten Schritt des Nuclear Egress fusioniert die primäre Hülle der Kapside mit der äußeren Kernmembran. Dieser Schritt wird höchstwahrscheinlich durch eine zelluläre Maschinerie vermittelt. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich dabei auf die AAA+ ATPase Torsin, die als einzige im endoplasmatischen Retikulum und im Kernspalt vorhanden ist. Es wurden die Auswirkungen der Überexpression (von Wildtyp und Mutanten) sowie die Erzeugung von Knock-outs (mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technik) auf die PrV-Vermehrung analysiert. Weder die Expression noch die einzelnen Gen Knock-outs zeigten signifikante Auswirkungen auf die Virusvermehrung. Ein gleichzeitiger Knock-out von Torsin A und B führte zu reduzierten Virustitern zu frühen Zeitpunkten nach der Infektion und einer Anhäufung primärer Virionen im Kernspalt. Auffällig war, dass die primäre Virushülle häufig noch mit der inneren Kernmembran verbunden war. Dies könnte darauf hindeuten, dass Torsine bei der Abschnürung der primären Viruspartikel eine Rolle spielen. Der Nuclear Egress wurde im Laufe der letzten Jahrzehnte intensiv untersucht. Um einige der noch unbekannten Aspekte zu beleuchten, wurden im Rahmen dieser Arbeit monoklonale Antikörper gegen den NEC sowie seine einzelnen Komponenten pUL31 und pUL34 generiert. Diese sollen zur besseren Visualisierung des NEC in transfizierten, aber auch infizierten Zellen dienen. Diese Antikörper sind ein nützliches Werkzeug für zukünftige Analysen. Mit der Aufklärung der Kristallstruktur des NEC wurde der Grundstein für eine genauere Untersuchung und Aufklärung der molekularen Details sowie seiner Wechselwirkungen mit dem Nukleokapsid gelegt. Unser Labor konnte kürzlich zeigen, dass ein Lysin (K) an Position 242 in pUL31 für den Einbau des Nukleokapsids in die primären Vesikel von entscheidender Bedeutung ist. Tauscht man das Lysin gegen ein Alanin (A) aus, werden zwar Vesikel von der inneren Kernmembrane abgeschnürt, aber keine Kapside eingebaut. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Lysin an Position 242 nicht nur gegen Alanin ausgetauscht, sondern auch durch eine Reihe anderer Aminosäuren mit unterschiedlicher Ladung oder Größe ersetzt, um zu untersuchen, ob der Effekt auf elektrostatische Interferenzen oder strukturelle Restriktionen zurückzuführen ist. Reversionsanalysen zeigten, dass der K242A-Defekt durch unterschiedliche Mutationen in pUL31 kompensiert werden konnte. Die große Zahl und Diversität dieser Mutationen weisen auf eine größere Flexibilität des NEC hin als bisher angenommen. Weiterhin ergaben sich Hinweise, dass das Lysin an Position 242 nicht direkt an der Kapsidinteraktion, sondern vermutlich eher an strukturellen Veränderungen in der NEC-Hülle beteiligt ist.

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Hölper, Julia: Herpesvirus Nuclear Egress and the Analysis of Involved Viral and Cellular Key Players. Greifswald 2020. Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie.

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