Etablierung des Gene Editing beim Huhn anhand der Modifikation des SLCO1B3-Gens

Altgilbers, Stefanie

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Etablierung des Gene Editing beim Huhn anhand der Modifikation des SLCO1B3-Gens

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PGCs, als Vorläufer-Zellen der Gameten können genetisch verändert, kryokonserviert, wieder aufgetaut und vermehrt werden und bieten somit großes Potential, genetische Ressourcen des Huhns zu konservieren. In dieser Arbeit wurden alle notwendigen Grundbausteine für die Generierung von genetisch veränderten Hühnern am Institut für Nutztiergenetik etabliert. Es konnten PGCs von Weiß- und Blaulegern generiert, kryokonserviert und erneut in vitro kultiviert werden. Mit Anwendung des Sleeping Beauty Transposon-Systems (SB) in PGCs war es möglich eine stabile Integration eines Venus-Transposons ins Hühnergenom vorzunehmen. Es wurden mit Hilfe von in vivo und in vitro Manipulationstechniken PGCs transfiziert und zell-mosaike, sowie zell-chimäre Hühner generiert. Die Basistechniken wie künstliche Insemination, Erstellung befruchteter Eier, Mikromanipulation von Hühnerembryonen zur Injektion von genetisch modifizierten PGCs, Embryonenkultur in Gastschalen mit effizienten Schlupfraten genetisch veränderter Hühner, sowie die Spermagewinnung von Keimbahnchimären wurden erfolgreich etabliert und durchgeführt. Neue Züchtungstechniken wie das CRISPR/Cas9-System wurden ebenfalls in verschiedenen Hühner Zell-Linien mit unterschiedlichem Genotyp angewandt. Zudem konnte das Auftreten einer 4.2 kb großen Deletion der gesamten proviralen Sequenz, die auf Chromosom 1 im Promotorbereich des SLCO1B3- Gens inseriert ist, gezeigt werden. Zur Detektion genetischer Modifikationen wurde ein Digital-PCR Assay etabliert, der eine exakte Quantifizierung der vorgenommenen Editierung erlaubt. Es ist gelungen einen soliden Grundstein für die Verwendung des Huhns als Tiermodell für weitere Projekte insbesondere im Bereich der neuen genetischen Züchtungsmethoden sowie für einen innovativen Ansatz für den Erhalt der genetischen Diversität zu legen.

PGCs as the precursors of sperm and ova can be genetically modified, cryopreserved, thawed and propagated in vitro again. In this study a good foundation has been set for the creation of genetic engineered chicken. Here, the proliferation of white- and blue egg layer PGCs, their cryo-preservation and rethawing for an expansion in vitro were achieved. With the application of the Sleeping Beauty transposon system (SB) it was possible to generate a stable integration of a Venus transposon into the chicken genome. Cell-mosaic and cell-chimeric chicken using in vivo and in vitro transfection technics for PGCs were produced. Based on in vitro transfection each hatched cock was cell-chimeric. Basic technics like artificial insemination, the creation of fertilized eggs, micromanipulation of chicken embryos for injection of genetically modified PGCs, embryo culture in surrogate eggshells with efficient hatching rate of genetically modified chicken as well as the semen collection from germline chimeras were successfully established and practiced. New breeding technologies such as the CRISPR/Cas9 system were applied in different chicken cell lines with different genotypes. A large deletion of 4.2 kb including the entire proviral sequence on chromosome 1 in the promotor region of the SLCO1B3 gene was achieved. For detecting genetic modifications in the chicken genome, a Digital-PCR assay was established to achieve an exact quantification of the targeting efficiency. It has been shown that the SB-system as well as the CRISPR/Cas9 system are suitable instruments for the genetic modification of the chicken genome. We succeeded in laying the cornerstone for using the chicken as an animal model for future projects in the scope of genetic engineering plus creating an innovative approach for the preservation of genetic diversity.