Design and functional characterization of a transposon for salivary specific expression of recombinant ligninase

Hyder, Iqbal

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Design and functional characterization of a transposon for salivary specific expression of recombinant ligninase

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The major limitation in feed grade utility of cereal straws is the presence of the high amount of lignin, a phenolic polymer that binds to holocellulose (cellulose and hemicellulose) making the aggregate unavailable for efficient bacterial fermentation in the rumen microbiome. Lignin in association with structural carbohydrates accounts for “unavailable/undigested” neutral detergent fiber (NDF), and according to an estimate even a 1 unit increase in forage NDF digestibility is associated with significant increase in dry matter intake and milk production, respectively. In spite of being highly diverse, the rumen microbiome lacks organisms that produce ligninase. Though there are thermochemical methods for delignification, they are environmentally unsustainable. Considering the importance of delignification both in livestock and bioenergy sector, the potential of genetic engineering can be exploited for the generation of cattle that express recombinant ligninase to digest fodder with a high content of lignocellulose. This would enable the double benefit of addressing the feed shortage in animals, and proper utilization of cereal straws in many developing countries. Here, a proof-of-principal for a functional ligninase expression in mammalian salivary cells was established. The approach was to construct a Sleeping Beauty transposon encoding a his-tagged ligninase cDNA driven by a salivary gland promoter, and assessing its functionality in immortalized rat salivary gland cells and primary bovine cells. Three different bacterial ligninases were chosen, and synthetic constructs codon-optimized gene were then ligated separately into a transposon vector. The vectors were then electroporated into immortalized rat salivary gland cells and bovine embryonic fibroblasts, and successfully transfected cells were sorted by a reporter fluorescence. The supernatant from the pure population of salivary cells was collected, up-concentrated and was subjected to Western blotting, in parallel, the supernatant was subjected to Ni-NTA agarose purification. In both supernatant and Ni-NTA purified eluate one of the ligninase proteins, DyP1, was detected. To check the functionality of the recombinant ligninase, an aqueous solution of model lignin compound, Kraft lignin, was added to the cultured ligninase-expressing salivary cells. At a threshold concentration of lignin, a characteristic cell death was observed in DyP1 expressing cells, which could be due to putative products derived from digested lignin. The activity of the recombinant ligninase was confirmed by photospectrometric analyses. Thus, these data are a primary basis for the generation of transgenic ruminants that produce ligninase in the salivary Gland. This alternative fodder resource for ruminants may reduce the need of high quality cereals for feeding of animals and may reduce the carbon footprints of livestock farming.

Die Haupteinschränkung der Verwendbarkeit von Getreidestroh in Futterqualität ist der hohe Ligninanteil, einem phenolischen Polymer, das an Holocellulose (Cellulose und Hemicellulose) bindet, wodurch der Komplex für eine effiziente bakterielle Fermentation im Pansenmikrobiom nicht verfügbar ist. Lignin in Verbindung mit strukturellen Kohlenhydraten ist für „nicht verfügbare / unverdaute“ neutrale Detergensfasern (NDF) verantwortlich, und Schätzungen zufolge ist selbst die Erhöhung der NDF-Verdaulichkeit um eine Einheit mit einer signifikanten Zunahme der Trockenmasseaufnahme und der Milchproduktion verbunden. Dem Pansenmikrobiom mangelt es trotz seiner großen Vielfalt an Organismen, die Ligninase produzieren. Es gibt zwar thermochemische Methoden zur Delignifizierung, diese sind jedoch nicht umweltverträglich. In Anbetracht der Bedeutung der Delignifizierung sowohl im Tier- als auch im Bioenergiesektor kann das Potenzial der Gentechnik für die Erzeugung von Rindern genutzt werden, die rekombinante Ligninase für den Verdau von Futtermitteln mit hohem Lignocellulose-Gehalt exprimieren. Dies würde den doppelten Vorteil der Bekämpfung des Futtermangels bei Nutzieren und der ordnungsgemäßen Verwendung von Getreidestroh in vielen Entwicklungsländern ermöglichen. In einem Pilotstudie wurde hier die funktionelle Ligninase-Expression in Speicheldrüsenzellen von Säugern etablieren. Der Ansatz bestand darin, ein Sleeping Beauty-Transposon zu konstruieren, das ein His-markiertes Ligninase-Konstrukt codiert, das von einem Speichelpromotor angetrieben wird, und dessen Funktionalität in immortalisierten Speicheldrüsenzellen und in primären Rinderzellen validiert wird. Drei bakterielle Ligninasen wurden ausgewählt, und synthetische condon-optimierte Konstrukte wurde dann separat in einen Sleeping Beauty-Transposonvector ligiert. Die Vektoren wurden in immortalisierte Speicheldrüsenzellen von Ratten und embryonale Rinderfibroblasten elektroporiert, und erfolgreich transfizierte Zellen wurden durch Reporterfluoreszenz sortiert. Der Überstand aus der reinen Population von Speichelzellen wurde gesammelt, aufkonzentriert und im Western-Blot beprobt. Parallel dazu wurde der Überstand einer Ni-NTA-Agarosereinigung unterzogen. Sowohl im Überstand, als auch im mit Ni-NTA gereinigten Eluat wurde eines der Ligninase-Proteine, DyP1, nachgewiesen. Um die Funktionalität der rekombinanten Ligninase zu überprüfen, wurde die Modell-Lignin-Verbindung, Kraft-Lignin zu den kultivierten Ligninase- exprimierenden Speicheldrüsenzellen gegeben. Bei einer Schwellenkonzentration von Lignin wurde in DyP1-exprimierenden Zellen ein charakteristischer Zelltod beobachtet, der auf Liginin- Abbauprodukte zurückzuführen ist. Die funktionelle Aktivität des DyP1-Enzyms wurde durch photospektrometrische Analysen bestätigt. Somit sind diese Daten eine Grundlage für die Erzeugung von transgenen Wiederkäuern, die rekombinante Ligninase in der Speicheldrüse produzieren. Diese alternative Futterressource für Wiederkäuer kann den Bedarf an hochwertigem Getreide für die Fütterung von Tieren, und die Kohlenstoffbilanz der Tierhaltung verringern.