Generation of a polled phenotype in cattle using CRISPR/Cas

Schuster, Felix GND

In modern livestock farming horned cattle pose an increased risk of injury for each other as well as for the farmers, whereas polled animals are easier in handling and tend to be less aggressive. Dehorning without anesthesia is associated with stress and pain for the calves and raises concerns regarding animal welfare. Naturally occurring mutations causing polledness are known for most beef cattle but are rarely distributed within dairy cattle populations such as Holstein-Friesians (HFs). In order to improve animal welfare, breeders agreed to increase the percentage of polled individuals within the populations. So far, the propagation of polled HFs is limited due to the low genetic merit of polled bulls. In beef cattle, a small mutation located within the horned locus on chromosome 1 consisting of a 208 bp duplication and a 6 bp deletion (Polled Celtic variant, Pc) causes the polled phenotype. In this project, we used the CRISPR/Cas12a system (formerly Cpf1) to introduce the Pc variant into the genome of adult fibroblasts taken from a horned HF bull. In order to generate living offspring, edited fibroblasts were used as donor cells for somatic cell nuclear transfer. Produced embryos were transferred into synchronized recipients. To further investigate the exact molecular background of horn ontogenesis, we created a novel knock-out mutation (horned locus knock-out, HLKO) in the horned locus to examine whether also random mutations in this intergenic area lead to a polled phenotype. Pregnancies with clones from Pc knock-in cells were established. The first pregnancy was terminated on day 90 in order to analyze the fetus for polledness. Genomic and phenotypic analyses strongly suggest the successful generation of a polled phenotype. Remaining pregnancies will be carried to term. Pregnancies with clones from fibroblasts carrying the HLKO mutation were established initially but could not be maintained past day 70. In conclusion, we successfully established procedures for efficient genome editing in cattle and thereby generated polled offspring from a horned HF bull within one generation.

In der heutigen Tierhaltung stellen horntragende Rinder ein erhöhtes Verletzungsrisiko sowohl für die Tiere als auch für Mitarbeiter dar, wohingegen hornlose Tiere leichter zu handhaben sind und weniger aggressives Verhalten zeigen. Das Enthornen ohne Betäubung ist mit Stress und Schmerz für die Tiere verbunden und somit aus Tierschutzgründen in Kritik geraten. Natürlich vorkommenden Mutationen, die zu Hornlosigkeit führen, sind für einige Fleischrinderrassen bekannt. In Milchviehrassen, wie zum Beispiel Holstein-Friesian (HF), sind diese Varianten jedoch selten verbreitet. Im Einklang mit dem Tierschutz haben sich die Züchter als Ziel gesetzt, den Anteil hornloser Individuen in den jeweiligen Populationen zu erhöhen. Die Zucht hornloser HFs stellt sich aufgrund geringer Zuchtwerte hornloser Zuchtbullen als schwierig dar. In Fleischrassen wurde eine kleine Mutation im horned locus auf dem Chromosom 1 lokalisiert, welche zu Hornlosigkeit führt. Sie besteht aus einer 208 bp Duplikation und einer 6 bp Deletion (Polled Celtic Variante, Pc). In diesem Projekt wurde das CRISPR/Cas12a System (ehemals Cpf1) verwendet, um die Pc Variante in das Genom adulter Fibroblasten eines horntragenden HF Bullen zu integrieren. Um lebende hornlose Nachkommen zu generieren wurden editierte Fibroblasten als Spenderzellen für den somatischen Kerntransfer verwendet und resultierende Embryonen in synchronisierte Empfängertiere transferiert. Um weitere Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen der Hornentstehung zu erlangen, wurde zudem eine neuartige knock-out Mutation im horned locus (horned locus knock-out, HLKO) hervorgerufen um zu überprüfen, ob auch beliebige Mutationen in diesem Lokus zur Hornlosigkeit führen. Mehrere Trächtigkeiten mit Klonen aus Polled Celtic knock-in Zellen konnten etabliert werden. Die erste Trächtigkeit wurde an Tag 90 terminiert, um den Fetus auf Hornlosigkeit zu untersuchen. Genomische und phänotypische Analysen zeigten keine Anzeichen für Hornanlagen. Die übrigen Trächtigkeiten wurden erhalten und sollen ausgetragen werden. Trächtigkeiten, welche aus Klonen entstanden, die die HLKO Mutationen trugen, konnten nicht über Tag 70 hinaus aufrechterhalten werden. Zusammenfassend konnte hier ein Verfahren zur effizienten Genomeditierung bei Rindern etabliert werden, welches es ermöglicht, innerhalb einer Generation einen hornlosen Nachkommen aus einem horntragenden HF Bullen zu generieren.

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Schuster, Felix: Generation of a polled phenotype in cattle using CRISPR/Cas. Hannover 2020. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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