Experimentelle Evaluierung zellbiologischer Methoden zur funktionalen Charakterisierung der Leader Protease des Maul- und Klauenseuche Virus

Schult, Kristin

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Experimentelle Evaluierung zellbiologischer Methoden zur funktionalen Charakterisierung der Leader Protease des Maul- und Klauenseuche Virus

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Die Maul- und Klauenseuche (MKS) stellt eine Tierseuche dar, die bei Ausbruch zu dramatischen wirtschaftlichen Verlusten durch Beeinträchtigung der anfälligen Tiere führt. Das verursachende Agens der Krankheit ist das Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV), welches der Familie der Picornaviren und der Gattung der Aphthoviren angehört. Ausbrüche der MKS weltweit sind selten, jedoch sollte der Erreger weiterhin erforscht werden, um ablaufende Prozesse besser verstehen, sichere und effiziente Impfstoffe entwickeln und im Falle eines Ausbruches angemessene Gegenmaßnahmen ausüben zu können. Das aus in etwa 8500 Basenpaaren bestehende Genom des Virus codiert unter anderem für die Leader Protease, ein wichtiger Virulenzfaktor, welcher unter anderem die Expression der Wirtsproteine durch die Spaltung des eukaryotischen Initiationsfaktors 4G (eIF4G) beeinträchtigt und ebenfalls die Immunantwort des Wirtes beeinflusst. In dieser Arbeit sollten verschiedene Systeme zur Untersuchung und Differenzierung der Funktionen der Leader Protease analysiert werden. Unter Zuhilfenahme unterschiedlich komplexer Systeme (Infektionssystem, Replikonsystem und Einzelexpressionssystem) erfolgte die Untersuchung der Translationsinhibierung, vermittelt über die eIF4G-Spaltung und der damit einhergehende Einfluss auf die Analyse auf andere Funktionen der Leader Protease. Sowohl im Infektionssystem als auch im hier etablierten Replikonsystem konnte die MKSV-induzierte Spaltung des eukaryotischen Initiationsfaktors 4G verifiziert werden. Hingegen konnte im Einzelexpressionssystem die Spaltung erst nach Lyse der Zellen nachgewiesen werden. Diese bisher noch nicht beschriebene Problematik lässt die bisher veröffentlichten Resultate und Schlussfolgerungen aus Einzelexpressionssystemen in Frage stellen. Die mit Hilfe des Einzelexpressionssystems durchgeführten Studien dieser Arbeit weisen darauf hin, dass ein zusätzlicher translationsinhibierender Mechanismus der Leader Protease, unabhängig von der proteolytischen eIF4G-Spaltung, ausgeübt wird. Dementsprechend sind die Möglichkeiten der Untersuchung zur Leader Protease mittels Einzelexpressionssystem sehr eingeschränkt, da eine Analyse spezifischer Leader Protease-Effekte unabhängig von einer Translationsinhibierung, dem „host-shut-off“, experimentell kaum möglich ist. Dies betrifft insbesondere die durchgeführten InterferonReportergenversuche. Somit konnten unter Verwendung verschiedener Untersuchungssysteme experimentelle Möglichkeiten, aber auch entscheidende experimentelle Limitierungen für die proteinbiochemische Analyse der Leader Protease-vermittelten eIF4G-Spaltung aufgezeigt werden.

Foot-and-mouth disease (FMD) is an animal disease that causes dramatic economic losses to susceptible animals during FMD outbreaks. The causative agent of the disease is the foot-and-mouth disease virus (FMDV), which belongs to the family of Picornaviruses and the genus Aphthoviruses. Outbreaks of FMD are rare worldwide, but research on the virus should be continued in order to better understand the molecular and cellular processes involved. This will help to develop safe and efficient vaccines and take appropriate countermeasures in the case of an outbreak. The genome of the virus (consisting of approximately 8500 base pairs) codes for the leader protease, an important virulence factor that interferes with the expression of host proteins by cleavage of the eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G) and furthermore influences the immune response of the infected host. In this thesis, different experimental systems for the investigation and differentiation of leader protease functions were analyzed. Using different experimental strategies (infection-, replicon-, & single expression-system) translation inhibition via eIF4G cleavage and its influence on other functions of the leader protease was investigated. The FMDVinduced cleavage of eIF4G could be verified for the infection- as well as for the repliconsystem. In the single expression-system, however, cleavage could only be seen after cell lysis. This experimental problem, which has not been described for FMDV before, questions previously published findings and conclusions from single expression-systems. The studies performed by the single expression-system indicate that an additional translation-inhibiting mechanism of the leader protease is active independently of the proteolytic eIF4G cleavage. Accordingly, the chance to investigate the leader protease by means of a single expression-system seems to be very limited, since an accurate analysis of specific leader protease effects independent of translation inhibition (the "host-shut-off") is apparently hardly possible. This applies in particular to the interferon reporter gene experiments. In summary, by using distinct investigation systems, experimental possibilities, but also decisive experimental limitations could be demonstrated for the biochemical characterization of the FMDV leader protease function.