Untersuchung von Virulenzdeterminanten des Newcastle Disease Virus mit Hilfe von Virusrekombinanten

Heiden, Sandra GND

Die Newcastle Krankheit (Newcastle Disease, ND) wird durch das aviäre Paramyxovirus-1 (APMV-1) verursacht und zählt zu den bedeutendsten Viruserkrankungen des Geflügels, wobei die Ausprägung der Krankheitssymptome sehr stark variiert. Das APMV-1 der Taube (pigeontype paramyxovirus, PPMV-1) infiziert größtenteils Brief-, Rasse-, Stadt- und Wildtauben, jedoch ist auch Wirtschaftsgeflügel für diesen Erreger empfänglich. Die Krankheit ist weltweit verbreitet und besonders die schweren Verlaufsformen, ausgelöst durch den mesogenen und den velogenen Pathogenitätstyp, führen bis heute zu hohen wirtschaftlichen Verlusten. Durch die Entwicklung des reversen genetischen Systems für das NDV ist es möglich, verschiedene Bereiche des viralen Genoms unterschiedlich pathogener NDV-Isolate auszutauschen und rekombinante Viren zu generieren, um mögliche Virulenzdeterminanten zu identifizieren. Lange Zeit galt die Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des Fusionsproteins als die Virulenzdeterminante des NDV. Studien der letzten Jahre belegen aber zunehmend, dass es weitere Sequenzabschnitte im Genom gibt, die Einfluss auf die Pathogenität haben. Besonders bei den Taubenisolaten zeigte sich, dass diese trotz einer polybasischen Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle des F-Proteins, die typisch für meso- und velogene APMV-1 ist, mit einem ermittelten intrazerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) < 0,7 als lentogen (niedrig virulent) einzuordnen sind. Die Bestimmung der Gesamtsequenz des vorliegenden PPMV-1 Isolates R75/98 und die Herstellung des entsprechenden rekombinanten Virus rR75/98 waren Ziel dieser Arbeit. Nach der in vitro-Charakterisierung, die keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Rekombinante zeigte, verdeutlichte die ICPI-Bestimmung, dass sich R75/98 und rR75/98 in ihrer Pathogenität unterschieden. Während R75/98 mit einem ICPI von 1,1 als mesogen eingestuft wurde, entsprach das rekombinante Virus rR75/98 mit einem ICPI von 0,28 dem lentogenen Pathotyp. Durch einmalige Passage der Rekombinante im Tier entstand das Reisolat RrR75/98, welches sich in seinen in vitro-Eigenschaften nicht von den beiden anderen Isolaten unterschied, aber in seiner Pathogenität (ICPI 0,93) wieder dem mesogenen Ausgansvirus R75/98 entsprach. Unter Nutzung des Next Generation Sequencing war es möglich, die Grundlagen für diese Pathogenitätsunterschiede aufzuzeigen. Während es zwischen R75/98 und rR75/98 insgesamt acht Aminosäuresubstitutionen gab (drei im F-Protein, zwei im HN-Protein und drei im L-Protein), die zu einer Verminderung der Pathogenität führten, wurden nur zwei Aminosäuremodifikationen (jeweils eine im F- und L-Protein) nachgewiesen, um die Pathogenitätssteigerung vom lentogenen rR75/98 hin zum mesogenen RrR75/98 hervorzurufen. Beide Aminosäureaustausche haben einen Effekt auf die vorhergesagte Proteinstruktur und beeinflussen vermutlich die Proteinfaltung, was wiederum eine nicht unwesentliche Auswirkung auf die biologische Aktivität des Virus haben kann. Besonders die Modifikation im F-Protein an Aminosäureposition 472 verdeutlicht, dass neben der Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle andere Bereiche dieses Proteins Einfluss auf die NDV-Virulenz haben. Zur Untersuchung des Einflusses einzelner Abschnitte des F-Proteins auf die Pathogenität wurden im ursprünglich lentogenen NDV Clone 30 einzelne Sequenzbereiche durch die des mesogenen PPMV-1 R75/98 substituiert, die entsprechenden rekombinanten Viren generiert und charakterisiert. Es zeigte sich, dass sowohl die Expression als auch die Inkorporation der chimären Fusionsproteine mittels Western-Blot nachgewiesen werden konnte. Die Rekombinanten unterschieden sich weder in Größe noch in Form (Elektronenmikroskopie) und die chimären Fusionsproteine konnten an der Plasmamembran der Wirtszellen detektiert werden. Alle Rekombinanten waren in der Lage, Synzytien auszubilden und in verschiedenen Zelllinien (Wachtelmuskelzelle, Hühnerembryofibroblasten) bzw. in embryonierten Hühnereiern zu replizieren. Bei der Bestimmung des ICPIs zeigten sich jedoch Unterschiede. Zwei der sechs Rekombinanten wurden als lentogen eingestuft, die anderen vier wurden dem mesogenen Pathogenitätstyp zugeordnet. Es konnte gezeigt werden, dass neben der Interaktion der homologen F1- und F2-Untereinheit, die zytoplasmatische Domäne des Fusionsproteins einen bedeutenden Einfluss auf die Pathogenität von NDV hat. Auch für andere Vertreter der Paramyxoviren ist bekannt, dass die zytoplasmatische Domäne der beiden Oberflächenproteine F und HN mit dem M-Protein interagiert und diese Interaktion wichtig für den Zusammenbau der Viruspartikel, den Knospungsvorgang und die Freisetzung der Viren ist. Neben dem Fusionsprotein existieren zusätzlich Virulenzdeterminanten in den weiteren NDV-Proteinen. Während es bereits Untersuchungen zum Einfluss auf die Pathogenität für die Proteine NP, P, V, M, F, HN und L gibt, war es noch nicht möglich, eine Aussage zum W-Protein zu treffen, da der Nachweis dieses Proteins bis dato nicht erfolgte. Zunächst wurde für unterschiedlich pathogene NDV der Bereich der P-Gen-Editierungsstelle amplifiziert, gefolgt von einer Tiefensequenzierung, um zusätzlich zur P- und V-mRNA auch die W-mRNA nachzuweisen und deren mengenmäßigen Anteil zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden außerdem Plasmide hergestellt, die für weiterführende Arbeiten genutzt werden konnten, in denen erstmals der Nachweis des W-Proteins für NDV gelang.

Newcastle Disease (ND) is caused by avian paramyxovirus-1 (APMV-1) and is one of the most important viral diseases of poultry, with strongly varying symptoms of disease. The APMV-1 of pigeon (pigeontype paramyxovirus, PPMV-1) mainly infects racing pigeons, purebred pigeons, city pigeons and wild pigeons, but poultry is also susceptible to this pathogen. The disease is widespread worldwide and especially the severe forms, caused by the mesogenic and the velogenic pathotype, lead to high economic losses. Using the reverse genetic system for NDV, it is possible to exchange different regions of the viral genome of NDV isolates with different pathogenicity and to generate recombinant viruses to identify possible virulence determinants. For a long time, the amino acid sequence at the proteolytic cleavage site of the fusion protein was regarded as the virulence determinant of NDV. However, studies in recent years have increasingly shown that there are further regions in the genome that influence pathogenicity. Especially pigeon isolates showed that despite presence of a polybasic amino acid sequence at the proteolytic cleavage site of the F protein, which is typical for meso- and velogenic APMV-1, they are classified as lentogenic (low virulent) with a determined intracerebral pathogenicity index (ICPI) < 0.7. The determination of the complete sequence of the PPMV-1 isolate R75/98 and the development of the corresponding recombinant virus rR75/98 were the aim of this work. After in vitro characterization, which did not show significant differences between wild type and recombinant virus, the ICPI determination showed that both R75/98 and rR75/98 differed in their pathogenicity. While R75/98 was classified as mesogenic with an ICPI of 1.1, the recombinant virus rR75/98 corresponded to the lentogenic pathotype with an ICPI of 0.28. The re-isolate RrR75/98 was recovered after a single animal passage. Its in vitro properties did not differ from those of the other two isolates, but its pathogenicity (ICPI 0.93) corresponded to the mesogenic initial virus R75/98. Using Next Generation Sequencing (NGS), it was possible to identify the causes of these differences in pathogenicity between the individual isolates. While between R75/98 and rR75/98 there were eight amino acid substitutions (three in the F protein, two in the HN protein and three in the L protein), only two amino acid modifications (one each in the F and L protein) were detected to explain the increase in pathogenicity from the lentogenic rR75/98 to the mesogenic RrR75/98. Both amino acid exchanges have an effect on the predicted protein structure and presumably influence protein folding, which in turn seems to have a significant effect on the biological activity of the virus. Especially the modification in the F protein at amino acid position 472 demonstrates that besides the amino acid sequence at the proteolytic cleavage site, other regions of this protein influence NDV virulence. To investigate the influence of individual regions of the F protein on NDV pathogenicity, individual regions in the originally lentogenic NDV Clone 30 were substituted by those of the mesogenic PPMV-1 R75/98, the corresponding recombinant viruses were generated and characterized. It was shown that the expression as well as the incorporation of the chimeric F-protein could be detected by western blot. The recombinants differed neither in size nor in form (electron microscopy) and the chimeric fusion proteins could be detected at the plasma membrane of the host cells. All recombinants were able to form syncytia and replicate in different cell lines (quail muscle cell, chicken embryo fibroblasts) or in embryonated chicken eggs. However, there were differences in the determination of the ICPI. Two of the six recombinants were classified as lentogenic, the other four were assigned to the mesogenic pathotype. Thus, besides the interaction of the homologous F1 and F2 subunit, the cytoplasmic domain of the fusion protein has a significant influence on the pathogenicity of recombinant NDV. It is also known for other paramyxoviruses that the cytoplasmic domain of the two surface proteins F and HN interacts with the M protein and that this interaction is important for the assembly of the virus particles, the budding process and the release of the viruses. In addition to the fusion protein, virulence determinants also exist in other NDV proteins. While there are already studies on the influence on pathogenicity for the proteins NP, P, V, M, F, HN and L, it was not possible to make a statement on the W protein until now, since this protein remained undetected. First, the region of the P gene editing site was amplified for differently pathogenic NDV, followed by deep sequencing to detect the W mRNA in addition to the P and V mRNA and to determine its relative level. In the context of this work, plasmids were also produced which could be used for further work in which the detection of the W protein for NDV was successful for the first time.

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Heiden, Sandra: Untersuchung von Virulenzdeterminanten des Newcastle Disease Virus mit Hilfe von Virusrekombinanten. Greifswald 2020. Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie.

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