Methoden zur Untersuchung der Allelfrequenzen und-verteilung im Acetolactat-Synthase (ALS)-Gen bei Target-Site-Resistenzen in Echinochloa crus-galli
Hühnerhirse (Echinochloa crus-galli) gewinnt als Ungras im Maisanbau zunehmend an Bedeutung. Einseitiger Einsatz von ALS-Inhibitoren erzeugt einen Selektionsdruck, der zu vermehrtem Auftreten von Resistenzen führt. Häufig handelt es sich um Target-Site-Resistenzen (TSR) mit Punktmutationen an den Positionen Ala-122, Pro- 197 oder Trp-574 des ALS-Gens. Dieses liegt in der hexaploiden Hühnerhirse in drei homologen Varianten vor. Gängige PCR-Verfahren ermöglichen nur eine gemeinsame Analyse aller Genvarianten, wodurch ein großer Teil des Informationsgehalts verloren geht. Für eine fundierte Aussage müssen die Genvarianten getrennt analysiert werden. Ein methodischer Ansatz war die allel-spezifische PCR. Hierfür wurden DNA-Polymorphismen zwischen den drei ALS-Genvarianten genutzt, um diese separat bei Position 574 hochspezifisch zu amplifizieren und zu sequenzieren. Die schwierige Struktur und geringe Polymorphismen verhinderten den Einsatz der allelspezifischen PCR an den Positionen 122 und 197. Hier wurden die drei Genvarianten gemeinsam amplifiziert und anschließend in einem mehrstufigen Ansatz mit Restriktionsenzymen spezifisch verdaut. Nach Separation, Aufreinigung und Reamplifikation der Fragmente wurden die einzelnen Genvarianten durch Pyrosequenzierung analysiert. So konnten an Position Ala-122 in allen ALS-Homologen heterozygote Mutationen nachgewiesen werden, bei Pro-197 und Trp-574 dagegen heterozygote bzw. homozygote Mutationen nur bei ALS3. Durch die Etablierung dieser Methoden können nun Resistenzmuster in Populationen von Echinochloa crus-galli detaillierter untersucht und wichtige Daten zu deren Ausbreitungsdynamik gewonnen werden.
Barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) is an important weed in maize. Rising selection pressure due to intensive use of ALS-inhibitors leads to an increase of resistances, of which target site resistances at positions Ala-122, Pro- 197 and Trp-574 of ALS gene are a common result. Three homologous variants of this gene are present within the hexaploid barnyardgrass. Standard PCR cannot differentiate between variants, giving a rough overview of mutations, but not the exact location. For well-founded evaluation, the variants must be analyzed separately. One way to do so is allele-specific PCR. Using DNA polymorphisms differing the variants from each other, specific amplification was performed at position 574. Insufficient polymorphisms at positions 122 and 197 called for another approach. A large fragment including all three variants was created and subsequently digested repeatedly to get specific segments for each variant. Segments were separated, cleaned, re-amplified and finally analyzed by pyrosequencing. Thus, it was possible to find heterozygous mutations at position Ala-122 for all ALS homologues. For Pro-197 and Trp-574 mutations (heterozygous as well as homozygous) were found only in variant ALS3. By establishment of the described methods resistance patterns within populations of Echinochloa crus-galli can be reviewed more closely, giving better insight to dynamics of spreading.
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