Flüchtige organische Substanzen als Biomarker von Infektionen mit Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis : Die Etablierung einer Methode zur Messung von flüchtigen organischen Substanzen im Headspace von Bakterienkulturen und im Atemgas von adulten Rindern und die Untersuchung von möglichen Einflussfaktoren

Einleitung Flüchtige organische Substanzen (volatile organic compounds, VOC) werden zunehmend als potentielle diagnostische Marker angesehen. Vor allem für Erkrankungen, bei denen bisherige Diagnostika nicht zufriedenstellend effizient sind, kann die Analyse von VOC über Bakterienkulturen bspw. zur Beschleunigung und Vereinfachung des kulturellen Nachweises beitragen. Aber auch für Krankheitsbilder, für die möglichst nicht-invasive Screeningmethoden gesucht werden, ist die Analyse von VOC im Atemgas oder im Gasraum über nativen Proben (z. B. Kot, Sputum, Harn) sehr vielversprechend. Paratuberkulose betrifft alle Haus- und Wildwiederkäuer und wird durch Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) verursacht. Infizierte Tiere entwickeln eine chronische granulomatöse Enteritis, wobei die Inkubationszeit Jahre umfasst und Symptome, wie intermittierende Diarrhoe und Gewichtsverlust, sehr unspezifisch sind. Aktuell verfügbare diagnostische Methoden sind arbeitsintensiv, langwierig, teuer und unzureichend sensitiv. Aufgrund der hohen Prävalenz von Paratuberkulose in Milchviehherden, ist eine schnelle, nicht-invasive und preiswerte Screeningmethode notwendig. Ziele Das Hauptziel dieser Arbeit war es ein robustes VOC-Profil im Gasraum über MAP-Kulturen zu finden, welches von anderen Mykobakterien-Spezies abgrenzbar ist, und dieses auf relevante Einflussfaktoren, die zu seiner Variabilität beitragen, hin zu untersuchen (in vitro). Ein weiteres Ziel war es einen technischen Aufbau zu etablieren, der es ermöglicht VOC im Atemgas von adulten Rindern unter Feldbedingungen in Echtzeit zu analysieren und diesen Aufbau an Tieren unterschiedlichsten Alters, Körperkondition und Atmungsfrequenzen anzuwenden und mögliche Einflussfaktoren zu definieren (in vivo). Material und Methoden In-vitro-Studien Mithilfe von In-vitro-Studien wurden Spezies-spezifische VOC-Profile erstellt, die im Gasraum über verschiedenen Mykobakterien zu messen sind. Dabei wurden 3 verschiedene MAP-Stämme und 12 weitere Mykobakterien-Spezies (15 verschiedene Stämme) eingesetzt und die Einflussfaktoren Nährmedium, Inkubationszeit und Keimzahl des Inokulates evaluiert. Unter Zuhilfenahme von Daten einer zuvor publizierten Studie wurde ein studienübergreifendes Core-VOC-Profil für MAP definiert und seine Robustheit statistisch analysiert und getestet. In-vivo-Studien Der technische Aufbau zur Atemgasanalyse in Echtzeit wurde an 83 klinisch gesunden adulten Rindern unter Feldbedingungen evaluiert. Physiologische Einflussfaktoren auf das Atemgasprofil, wie Tag, Tageszeit und Adaptation an die Untersuchungsbedingungen, wurden mithilfe einer experimentellen Studie an zwei Jungrindern getestet. Ergebnisse In-vitro-Studien Das Vorkommen von replizierenden Mykobakterien (mit speziellem Hinblick auf MAP) konnte mithilfe der VOC-Analytik im Gasraum der Bakterienkulturen detektiert werden. Vergleichend zu den Substanzkonzentrationen in den Kontrollröhrchen gab es VOC, deren Konzentration über den Bakterienkulturen anstieg und Substanzen, deren Konzentration abfiel. Aus den Ergebnissen von drei Studien konnte ein MAP-assoziiertes Core-VOC-Profil extrahiert werden. Es setzte sich aus 28 Substanzen sechs verschiedener chemischer Stoffklassen zusammen (Aldehyde, Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Furane, Ketone und Ester), die in allen drei Studien jeweils die gleiche Tendenz aufwiesen (Konzentrationsanstieg bzw. –abfall). Die Faktoren Inkubationszeit und Keimzahl des Inokulates haben einen quantitativen Einfluss auf die einzelnen Substanzen des VOC-Profils. Unterschiedliche Nährmedien haben sowohl einen quantitativen als auch einen qualitativen Einfluss. In-vivo-Studien Die methodisch erstmals etablierte Atemgasanalyse in Echtzeit wurde von allen Tieren gut toleriert und war unabhängig der Atmungsfrequenz zuverlässig durchführbar und produzierte vertrauenswürdige Daten. Mithilfe des Online-Messverfahrens konnten sowohl kurz- bis mittelfristige als auch langfristige Änderungen der Substanzkonzentration registriert und getrennt analysiert werden. Dies zeigte sich durch die bei Wiederkäuern physiologisch auftretenden Eruktionen von Pansengas, die zu einem Konzentrationsanstieg der meisten VOC der sich an die Eruktion anschließenden Exspirationen führte. Die VOC unterlagen tageszeitlichen Schwankungen und variierten in ihrer Konzentration auch aufgrund der Messung an unterschiedlichen Tagen. Stress schien auf die Mehrheit von Substanzen einen hohen quantitativen Einfluss zu haben. Schlussfolgerungen In-vitro-Studien Das bakterielle VOC-Profil unterliegt einer Reihe von Einflussfaktoren, die für eine potentielle diagnostische Anwendung zukünftig standardisiert werden müssen. Des Weiteren gibt es Faktoren, wie z. B. Alter oder Charge des Nährmediums, die ebenfalls einen Einfluss haben, allerdings nicht standardisierbar sind. Obwohl die standardisierbaren als auch die nicht standardisierbaren Einflussfaktoren in den drei Studien teilweise Unterschiede aufwiesen, ergaben die beiden statistischen Tests ähnliche Ergebnisse, sodass davon ausgegangen werden kann, dass das studienübergreifende Core-VOC-Profil für MAP robust ist. Mit der Überprüfung dieses MAP-anzeigenden VOC-Profil über nativen Proben (Kot oder Gewebe) und der weiteren Abgrenzung dieses Profils zu anderen Bakterienfamilien wird sich das diagnostische Potential und die damit verbundene Spezifität und Sensitivität der Methode weiter herausstellen. In-vivo-Studien Eine Atemgasanalyse in Echtzeit ist vor allem dann notwendig, wenn kurz- bis mittelfristige Änderungen der Substanzkonzentrationen während der Messung zu erwarten sind. Dies zeigte sich in unseren Untersuchungen durch das Auftreten von Kontaminationen des Atemgases durch Pansengase. Mithilfe des Online-Messverfahrens konnte gezeigt werden, dass die Eruktionen bei Rindern einen quantitativen Einfluss auf die VOC-Konzentrationen in den darauffolgenden Exspirationen haben. Des Weiteren haben die evaluierten Einflüsse von (Tag, Tageszeit und Handling bzw. Stress) gezeigt, dass auch Atemgasmessungen standardisiert werden sollten um reproduzierbare Ergebnisse zu erlangen.