Effects of peripartal energy supply and nicotinic acid supplementation on functional activity and gene expression of blood leukocytes and on serum antioxidant variables of periparturient dairy cows

Bühler, Susanne GND

Periparturient dairy cows experience vast physiological, metabolic, hormonal and immunological changes during the transition from late gestation to early lactation. This period is furthermore associated with oxidative stress, inflammation and immunosuppression and a high incidence in metabolic and infectious diseases. Since the energy intake does not meet the energy requirement that accompanies the needs for foetus growth and starting milk production, the animals experience a negative energy balance that makes it necessary for the cow to mobilise energy reserves from body tissues. The increased lipolysis in adipose tissue leads to increased blood concentrations of NEFA and subsequently, since the liver is not able to use up all these fatty acids in energy conversion through the Krebs cycle, of increased BHB blood concentrations. Both, NEFA and BHB are adversely affecting blood immune cell functions and are thought to play a major part in the immunosuppression during the transition period that leaves the animals more susceptible to infectious diseases like mastitis and metritis. In particular, NEFA also induces inflammatory processes through the TLR4 pathway. Niacin is known to have anti-lipolytic effects and has the potential to decrease postpartum NEFA and BHB concentrations but it is also described to exert anti-inflammatory and anti-oxidative influences on immune cells. Therefore, it seems to be an ideal supplementation to test in the periparturient period. To study possible influences of niacin on the functions of blood immune cells and anti-oxidative serum parameters in the periparturient dairy cow a feeding experiment was undertaken that aimed at inducing different degrees of lipolysis. To address this, 29 pluri- and 18 primiparous healthy and pregnant German Holstein-Friesian dairy cows were allocated homogenously to four different feeding groups considering their body weight, BCS as well as number of lactations and milk yield of previous lactations. The experiment started 42 days before expected parturition and ended at 100 DIM. Before parturition, the cows received either a low concentrate diet (30% concentrate and 70% roughage on dry matter (DM) basis; LC) or a high concentrate diet (60% concentrate and 40% roughage on DM basis; HC) with or without a supplementation of 24 g per day and cow of powdered non-rumen protected NA resulting in the feeding groups LC-NA and HC-NA as well as LC-CON and HC-CON. Supplementation was applied from 42 days antepartum until 24 DIM. After parturition, all animals received initially a diet of 30% concentrate and 70% roughage. This concentrate proportion was increased up to 50% either within 16 days (LC animals) or 24 days (HC animals) and was maintained at 50% until the end of the trial. Blood samples were collected from the Vena jugularis externa. Polymorphonuclear leukocytes (PMN) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were examined on a functional level with flow cytometry. Apoptosis was investigated with an Annexin V and propidium iodide (PI) based assay and distinguished into early apoptotic (annexin V + and PI -) and late apoptotic (annexin V + and PI +) cells. Phagocytosis was determined by the ingestion of FITC-labeled opsonized E.coli and the capability of PMN to produce reactive oxygen species (ROS) was examined by the intracellular oxidation of the non-fluorescent dye dihydrorhodamine 123 (DHR) to the fluorescent rhodamine 123. In addition, the expression of apoptotic (BAX, BCL2, BCL-xL, CASP3 and RELA) and oxidative stress-related (GPX1, NRF2, PARP1, SOD2 and XDH) genes was quantified with real-time PCR in blood leukocytes. Furthermore, serum enzyme activities of glutathione peroxidase (GPX) and superoxide dismutase (SOD) were analyzed spectrophotometrically as well as serum ferric reducing ability (FRA) by the conversion of Fe3+-tripyridyltriazine to Fe2+- tripyridyltriazine. Although the feeding experiment achieved no differences in lipolysis as seen by uninfluenced NEFA and BHB values, all measured variables exhibited a time dependency which was mainly related to parturition. PBMC were characterized by a more pronounced apoptosis than PMN and early apoptosis in PBMC was significantly influenced by concentrate level. The HC groups showed higher numbers of apoptotic cells than the LC groups. LC animals exhibited a decrease in the expression of the anti-apoptotic gene BCL2 before parturition, whereas the HC animals showed a continuous increase. Additionally, apoptosis in blood leukocytes correlated to energy variables. Serum GPX activity was higher in HC animals. Oxidation variables were strongly influenced by parity. Pluriparous cows exhibited higher expression levels for the oxidative stress related genes GPX1, SOD2 and XDH, higher serum GPX activity, increased percentages of phagocytizing PBMC and a greater proportion of basal ROS production in PMN. Whereas, primiparous animals showed higher RELA gene expression and SOD serum activity. Nicotinic acid supplementation did exhibit some influence in increasing numbers of early apoptotic PMN and late apoptotic PBMC between 42 and 100 DIM and increased the percentage of basal ROS producing PMN at 84 DIM. It furthermore tended to increase PBMC phagocytosis and decreased FRA values in the 2 weeks after parturition. The present study confirmed that parturition is a period of multifold changes with considerable impact on blood immune cell functional activity and gene expression as well as on antioxidant serum parameters. Parity in this context plays an important role, since animals differing in age had different prerequisites and functional abilities in blood leukocytes to respond to the stressful period of parturition. However, the changes in functional activity and capability of blood leukocytes can not be interpreted as dysfunctional responses. They rather represent the adaptation to the challenges during the transition phase. Energy availability however seems to play a major role in this respect.

Peripartale Milchkühe durchleben große physiologische, metabolische, hormonelle und immunologische Veränderungen während des Übergangs von der späten Trächtigkeit in die frühe Laktation. Zudem ist diese Periode mit oxidativem Stress, Entzündungen, Immunsuppression und einer hohen Inzidenz an Stoffwechsel- und Infektionskrankheiten verbunden. Da die Energieaufnahme den Energiebedarf nicht deckt, der mit dem Wachstum des Fötus und der Milchproduktion einhergeht, erleben die Tiere eine negative Energiebilanz, welche es notwendig macht, dass die Kuh Energiereserven aus dem Körpergewebe mobilisiert. Die erhöhte Lipolyse des Fettgewebes führt zu erhöhten Blutkonzentrationen von NEFA und, da die Leber nicht in der Lage ist, all diese Fettsäuren bei der Energieumwandlung durch den Krebs-Zyklus zu verbrauchen, folglich auch zu erhöhten BHB Konzentrationen im Blut. NEFA als auch BHB beeinträchtigen Funktionen von Immunzellen des Blutes und spielen eine wichtige Rolle bei der Immunsuppression während der Übergangszeit, welche die Tiere anfälliger für Infektionskrankheiten wie Mastitis und Metritis macht. Im Besonderen induziert NEFA auch Entzündungsprozesse über den TLR4-Weg. Es ist bekannt, dass Niacin anti-lipolytische Wirkung und das Potential besitzt, postnatale NEFA- und BHB-Konzentrationen zu verringern, aber es wird auch beschrieben, dass Niacin entzündungshemmende und anti-oxidative Einflüsse auf Immunzellen ausübt. Niacin schein daher ein ideales Futterergänzungsmittel zu sein, um es in der peripartalen Periode zu testen. Um mögliche Einflüsse von Niacin auf die Funktion von Blutimmunzellen und anti-oxidative Serumparameter in der peripartalen Milchkuh zu untersuchen, wurde ein Fütterungsversuch unternommen, der verschiedene Ausprägungen von Lipolyse induzieren sollte. Hierzu wurden 29 pluri- und 18 primipare gesunde und trächtige Milchkühe der Rasse Deutsche Holstein gleichmäßig in vier verschiedene Fütterungsgruppen hinsichtlich ihres Körpergewichts, BCS, der Laktationszahl sowie der Milchleistung vorangegangener Laktationen eingeteilt. Das Experiment begann 42 Tage vor der erwarteten Kalbung und endete 100 Tage nach dem Abkalben. Vor der Kalbung erhielten die Kühe entweder eine Diät mit niedrigerem Kraftfutteranteil (30% Kraftfutter und 70% Raufutter auf Trockenmassebasis; LC) oder eine Diät mit höherem Kraftfutteranteil (60% Kraftfutter und 40% Raufutter auf Trockenmassebasis; HC) mit oder ohne eine Supplementierung von 24 g pulverförmiger nicht Pansen-geschützter NA pro Tag und Kuh, was zu den Fütterungsgruppen LC-NA und HC-NA sowie LC-CON und HC-CON führte. Die Supplementierung wurde von 42 Tagen antepartum bis zum 24. Laktationstag appliziert. Nach dem Abkalben erhielten alle Tiere zunächst eine Diät mit 30% Kraftfutter und 70% Raufutter. Dieser Kraftfutteranteil wurde bei den LC-Tieren innerhalb von 16 Tagen und bei den HC-Tieren innerhalb von 24 Tagen auf 50% erhöht und bis zum Ende des Versuchs beibehalten. Blutproben wurden von der Vena jugularis externa gesammelt. Polymorphkernige Leukozyten (PMN) und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden auf funktioneller Ebene mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Apoptose wurde mit einem auf Annexin V und Propidiumiodid (PI) basierenden Test untersucht und in früh-apoptotische (Annexin V + und PI -) und spät-apoptotische (Annexin V + und PI +) Zellen unterschieden. Die Phagozytose wurde durch die Aufnahme von FITC-markierten opsonisierten E.coli Bakterien bestimmt und die Fähigkeit von PMN, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu produzieren, wurde durch die intrazelluläre Oxidation des nicht-fluoreszierenden Farbstoffs Dihydrorhodamin 123 (DHR) zum fluoreszierenden Rhodamin 123 untersucht. Zusätzlich wurde die Expression von apoptotischen (BAX, BCL2, BCL-xL, CASP3 und RELA) und oxidativem Stress assoziierten (GPX1, NRF2, PARP1, SOD2 und XDH) Genen in Blutleukozyten mittels Real-Time PCR quantifiziert. Darüber hinaus wurden die Serum-Enzym-Aktivitäten von lutathionperoxidase (GPX) und Superoxiddismutase (SOD) spektrophotometrisch analysiert sowie die Eisen-Reduktionsfähigkeit (FRA) des Serums durch die Umwandlung von Fe3+ -Tripyridyltriazin zu Fe2+ -Tripyridyltriazin bestimmt. Obwohl das Fütterungsexperiment keine Unterschiede in der Lipolyse hervorrief, wie die unbeeinflussten NEFA- und BHB-Werte zeigten, wiesen alle gemessenen Variablen eine Zeitabhängigkeit auf, die hauptsächlich auf die Abkalbung zurückzuführen war. PBMC waren durch eine ausgeprägtere Apoptose als PMN gekennzeichnet, und die frühe Apoptose in PBMC wurde signifikant durch den Kraftfutteranteil der Diät beeinflusst. Die HC-Gruppen zeigten eine höhere Anzahl an apoptotischen Zellen als die LC-Gruppen. LCTiere zeigten vor der Geburt eine Abnahme der Expression des anti-apoptotischen Gens BCL2, während die HC-Tiere einen kontinuierlichen Anstieg zeigten. Zusätzlich korrelierte Apoptose in Blutleukozyten mit Energievariablen. Die Serum-GPX-Aktivität war bei HCTieren höher. Die Oxidationsvariablen wurden stark von der Parität beeinflusst. Pluripare Kühe zeigten höhere Expressionsniveaus für die mit oxidativem Stress in Zusammenhang stehenden Gene GPX1, SOD2 und XDH, höhere Serum-GPX-Aktivität, erhöhte Prozentsätze an phagozytierenden PBMC und einen größeren Anteil an basaler ROSProduktion in PMN. Primipare Tiere zeigten eine höhere RELA-Genexpression und SODSerumaktivität. Die Supplementierung mit Nicotinsäure zeigte einen gewissen Einfluss auf die Zunahme der früh-apoptotischen PMN und der spät-apoptotischen PBMC zwischen 42 und 100 Tage nach der Abkalbung und erhöhte den Anteil an basal ROS produzierenden PMN am 84. Laktationstag. Die NA Supplementierung tendierte außerdem dazu, die PBMC-Phagozytose zu erhöhen und die Eisen-Reduktionsfähigkeit des Serums (FRA) in den 2 Wochen nach der Abkalbung zu verringern. Die Studie bestätigte, dass die Kalbung ein Zeitraum von vielfachen Veränderungen mit beträchtlichen Auswirkungen auf die funktionelle Aktivität und Genexpression von Immunzellen des Blutes sowie auf anti-oxidative Parameter des Serums ist. Parität spielt in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle, da Tiere mit unterschiedlichem Alter unterschiedliche Voraussetzungen und Funktionsfähigkeiten in Blutleukozyten haben, um auf die stressreiche Zeit des Gebärens zu reagieren. Die Veränderungen in der funktionellen Aktivität und Fähigkeit von Blutleukozyten können jedoch nicht als dysfunktionale Reaktionen interpretiert werden. Sie repräsentieren vielmehr die Anpassung an die Herausforderungen in der Übergangsphase. Die Verfügbarkeit von Energie scheint jedoch in dieser Hinsicht eine wichtige Rolle zu spielen.

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Bühler, Susanne: Effects of peripartal energy supply and nicotinic acid supplementation on functional activity and gene expression of blood leukocytes and on serum antioxidant variables of periparturient dairy cows. Halle-Wittenberg 2019. Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg.

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