From low to high pathogenicity: characterization of avian influenza viruses of subtypes H7 and H5

Graaf, Annika

Aviäre Influenzaviren (AIV) stellen eine der dominantesten und komplexesten Tiergesundheitsgefahren in der weltweiten Geflügelproduktion dar und können aufgrund ihres teilweise zoonotischen Charakters auch Bedeutung für die öffentliche Gesundheit erlangen. Nach ihrer Virulenz in Hühnern werden niedrig- (LP) und hoch pathogene (HP) AIV unterschieden. LPAIV der Subtypen H5 und H7 können durch spontane insertionelle Mutationen im HA Gen zu HP Phänotypen mutieren. Die Replikation von LPAIV H5 bzw. H7 in galliformen Hausgeflügel scheint eine Voraussetzung für das Entstehen der LP-zu-HP Mutationen darzustellen. Es bestehen kontinuierliche Risiken neuer LPAIV Einträge aus der Wildvogelpopulation sowie der lateralen Verbreitung einmal entstandener HPAIV in Hausgeflügel und deren Rückübertragung in Wildvogelpopulationen. Die stete Anpassung geeigneter Diagnose-, Kontroll- und Präventionsmaßnahmen an die virale Evolution ist von äußerster Wichtigkeit. Die in dieser Dissertation zusammengefassten Arbeiten betreffen die Entwicklung verbesserter diagnostischer Verfahren zur Pathotypisierung. Mithilfe von quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCRs), welche die Hämagglutinin Spaltstelle von AIV der Subtypen H5 und H7 charakterisieren, ist es möglich, die LP- und HPtypische Nukleotidsequenzen in diesem Bereich zu differenzieren. Sie stellen eine Alternative zur tierversuchs- und sequenzierungs-abhängigen Pathotypisierung dar und beschleunigen somit die Diagnose und reduzieren die Reaktionszeiten im Rahmen anzeigepflichtiger Infektionsgeschehen. Außerdem konnte die Eignung der entwickelten diagnostischen Tests als Routinemethode im Feld auf Populationsebene durch Anwendung in der molekular-epidemiologischen Aufarbeitung eines LP/HPAIV H7N7 Ausbruchsgeschehens in zwei Legehennenbeständen in Deutschland im Jahr 2015 belegt werden. So gelang der Nachweis eines LP-Vorläufervirus und dessen mutierter HP-Version in Tupferproben der HPAI Ausbruchsfarm mittels der pathotypspezifischen RT-qPCR, Vollgenomsequenzen und H7-spezifischen serologischen Tests. Ein weiterer Einsatz der neuen diagnostischen Verfahren ergab sich in der Pathogeneseforschung zur Ausbreitung von LPAIV und HPAIV in Geweben experimentell infizierter Hühner und embryonierten Hühnereiern. Dazu wurden Ko-Infektionen unter Verwendung des beschriebenen natürlichen LP/HP H7N7 Viruspaares durchgeführt. Hierdurch sollte die Entstehung von HP Mutanten in mit LP Virus infizierten Tieren simuliert werden. Hühner bzw. embryonierte Hühnereier wurden mit einer konstanten LPAIV-Inokulumdosis und steigenden HPAIV Titern ko-infiziert. U.a. mittels pathotyp-spezifischer RT-qPCRs konnte gezeigt werden, dass die LPKo-Infektion einen signifikant hemmenden Einfluss auf die HP H7-Replikation, die virale Ausscheidungskinetik sowie die Virusübertragung auf nicht infizierte Kontakttiere zur Folge hatte. Klinische, immunhistologische und serologische Daten bestätigten diese Beobachtungen. Es konnte gezeigt werden, dass HP-Varianten, die de novo in einem bereits mit dem antigenetisch identischen LP-Vorläufer infizierten Tier entstehen, Hindernisse in Bezug auf direkt virale Interferenz, angeborene und adaptive Immunität überwinden müssen, um auf andere Hühner überzutragen zu werden. Die hier erarbeiteten Methoden stellen eine wichtige Optimierung der Diagnostik von AI Infektionen dar. Darüber hinaus konnten die neuen Techniken als Forschungs-Werkzeuge hin zu einem tieferen Verständnis grundlegender Prozesse in der de novo Entstehung von HPAIV aus LPAIV Vorläufern beitragen. Die beschriebenen diagnostischen Tests weisen dennoch Limitationen auf und sind hauptsächlich für den Einsatz in Screening-Programmen, insbesondere in Regionen mit längerfristig ablaufenden AI-Infektionswellen, vorgesehen. Wenn es um die Ersterkennung und -charakterisierung neuer AIV-Ausbrüche geht, müssen die neu entwickelten Tests ggf. anhand der spezifischen Spaltstellensequenz adaptiert werden.

Avian influenza viruses (AIV) are one of the most dominating and complex animal health threats in poultry production globally. Due to the zoonotic propensity of some AIV strain they may also have public health significance. According to their virulence in chickens, AIV can be distinguished into low pathogenic (LP) and highly pathogenic (HP) AIV. LPAIV of subtypes H5 and H7 have the ability to mutate into HP phenotypes through spontaneous insertional mutations in the hemagglutinin (HA) gene. The replication of LPAIV H5 or H7 in galliform poultry seems to be a prerequisite for the development of LP-to-HP mutations. There are continuing risks of new LPAIV incursions from the wild bird population as well as lateral spread of LP and HPAIV in domestic poultry and their re-transmission into wild bird populations. The continuing adaptation of appropriate diagnostic, control and prevention measures to meet viral evolution is of utmost importance. The work collected in this thesis presents the development of improved diagnostic methods for pathotyping. By using realtime quantitative polymerase chain reactions (RT-qPCRs) that characterize the HACS of AIV subtypes H5 and H7, we are capable to differentiate LP and HPAIV based on the HACS nucleotide sequences. They represent an alternative to animal experiments and sequencingdependent pathotyping and thus aid in speeding up time-to-diagnosis and reduce reaction times of veterinary authorities in the context of notifiable outbreak infection events. In addition to this, the suitability of the newly developed diagnostic tools as a routine method in the field at the population level was applied in molecular-epidemiological follow-up studies of a combined LP/HPAIV H7N7 outbreak in two laying hen holdings in Germany in 2015. Using the H7 pathotyping RT-qPCRs, detection of LP/HP co-infections in swab specimens of the HPAI outbreak farm was achieved and, along with full-genome sequencing and H7-specific seroconversion of parts of the chicken population, a LP progenitor virus and its de novo mutant HP successor were demonstrated in the field. Finally, the new pathotyping diagnostic tools also proved advantageous in pathogenesis research on the spread of LP and HPAI viruses in tissues of experimentally co-infected chickens and embryonated chicken eggs (ECE). For this purpose, the recently detected natural LP/HP H7N7 pair of viruses was used to mimic the development and amplification of HPAIV mutants in LPAIV-infected animals. Chickens or ECE were co-infected with a constant amount of LPAIV and increasing HPAIV titres. Pathotype-specific RT-qPCRs were used to demonstrate that LP co-infection had a significant inhibitory effect on HP H7 replication, viral excretion kinetics, and viral transmission to non-infected contact animals. Clinical, immunohistological and serological data confirmed these observations and revealed that HP variants arising de novo in an animal already infected with the antigenically identical LP precursor have to overcome obstacles related to direct viral interference, innate and adaptive immunity in order to be spread to other chickens. The methods developed here add an important optimization to the diagnosis of AI infections in birds. In addition, they contribute as tools in research to a deeper understanding of basic processes in the de novo generation and spread of HPAIV from LPAIV precursors. Nevertheless, the described diagnostic tests have limitations and are intended to be used mainly in screening programs, especially in regions with longer-term AI infection waves. When it comes to the initial recognition and characterization of new AIV outbreaks, the new pathotyping RT-qPCRs may need to be adapted based on the specific CS sequence of the actual virus strain in circulation.

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Graaf, Annika: From low to high pathogenicity: characterization of avian influenza viruses of subtypes H7 and H5. Münschen 2019. Ludwig-Maximilians-Universität München, Tierärztliche Fakultät.

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