Generation and visualization of reporter gene expressing Influenza A viruses and visualization of influenza virus infection in murine lung tissue

Ullrich, Stephanie

Understanding viral kinetics during infection in tissues and cell cultures plays a central role in virus research. One major technique used is fluorescence imaging of viruses and host factors. In this thesis, a GFP-encoding variant of H3N2 swine IAV SB03 was modified in order to investigate the impact of truncation and elongation of a predicted packaging sequence on GFP expression and virus replication kinetics. The modified PB2 segment comprises a GFP and a PB2 ORF separated by a P2A site to enable translation of both proteins from one mRNA. In order to achieve segment packaging, a 99 nucleotides spanning sequence coding for the N-terminus of the PB2 protein was located upstream of the GFP ORF. To prevent sequence repetitions and perhaps interferences of two packaging signals in the PB2 segment, the respective sequence in the PB2 ORF was modified by multiple silent mutations. Both truncation and elongation of the predicted packaging sequence by 21 nucleotides were tolerated as shown by positive rescue of the recombinant viruses rSB03-GFP_2A_PB2-21N and rSB03-GFP_2A_PB2+21N and detection of GFP fluorescence in virus-infected MDCKll cells. Furthermore, an IAV in which all three PB2-derived ATG start codons were mutated to guanine or adenine residues was rescued, whereas virus rescues were unsuccessful after deletion of 72 nucleotides of the packaging signal, indicating that the minimal length of the respective PB2 segment sequence is between 78 and 27 nucleotides. Notably, growth curves with plaque-purified viruses rSB03-GFP_2A_PB2 and rSB03-GFP_2A_PB2-21N demonstrated decreased virus titers of 0.5 and 1.0 logs, respectively, when compared to wildtype rSB03 virus. This indicates a slight decrease in replication by GFP insertion and truncation of the signal sequence. By characterization of the GFP-expressing swine influence viruses, an important contribution to the development of reporter expression virus tools for further research has been performed. Additionally, three-dimensional imaging of IAV-infected mouse lungs was performed, using the tissue clearing method uDISCO (Pan et al., 2016) in combination with the immunostaining protocol described in iDISCO (Renier et al., 2014). Two different antibodies against IAV were tested, one targeting NP and another that is able to recognize complete virus. Both antibodies were successfully used for the detection of IAV infection in 1 mm thick mouse lung tissue slices. The three-dimensional distribution of the virus was visualized and individually infected cells were observed by confocal laser scan microscopy at high resolution. Together with the testing of a first epithelial cell marker, the novel uDISCO-based imaging protocols have been adapted to IAV detection in the context of mouse lung tissue. Thus, this work provides an important tool for future research on IAV infection in vivo.

Das Verständnis viraler Kinetiken während des Infektionsprozesses in Gewebe und Zellkultur spielt eine zentrale Rolle in der virologischen Forschung. Eine Schlüsseltechnik ist hierbei die Darstellung von Viren und Wirtsfaktoren über Immunfluoreszenz. In dieser Arbeit wurde eine GFP-kodierende Variante des H3N2 Schweine IAVs SB03 modifiziert, um den Einfluss von Verkürzungen und Verlängerungen der beschriebenen Verpackungssequenz auf die GFP-Expression und virale Replikationskinetik zu untersuchen. Das modifizierte PB2 Segment beinhaltet ein GFP und ein PB2 ORF, welche durch eine P2A Schnittstelle voneinander getrennt sind, wodurch die separate Translation beider Proteine von einer mRNA gewährleistet wird. Um eine Verpackung des Segments zu ermöglichen, wurde eine 99 Nukleotide umfassende Sequenz, welche für den N-Terminus des PB2 Proteins kodiert, vor das GFP ORF eingefügt. Um Sequenzwiederholungen und mögliche Interferenzen von zwei Verpackungssignalen zu vermeiden, wurden in der entsprechenden Region des PB2 ORFs die maximale Anzahl an stillen Mutationen eingefügt. Ein erfolgreicher Rescue, sowie eine positive GFP Fluoreszenz in mit den rekombinanten Viren rSB03-GFP_2A_PB2-21N und rSB03-GFP_2A_PB2+21N infizierten MDCKll Zellen zeigte, dass sowohl eine Verkürzung, als auch Verlängerung der beschriebenen Verpackungssequenz um 21 Nukleotide toleriert wird. Des Weiteren konnte ein IAV in welchem alle drei Startkodons innerhalb der hinzugefügten Sequenz mutiert wurden gerescued werden, im Gegensatz zu einem IAV mit um 72 Nukleotide verkürzter Verpackungssequenz. Aus letzterem lässt sich schließen, dass die minimal tolerierbare Länge des Verpackungssignals vermutlich zwischen 78 und 27 Nukleotiden liegt. Für die beiden Plaque-aufgereinigten Viren rSB03-GFP_2A_PB2 und rSB03-GFP_2A_PB2-21N wurden Wachstumskurven generiert, welche im Vergleich zu dem Wildtyp Virus rSB03 einen um 0,5 beziehungsweise 1,0 logs verringerten End-Titer 48 Stunden nach Infektion aufwiesen. Dies weist darauf hin, dass die Insertion des GFP ORFs und die Modifikationen in dem Verpackungssignal einen negativen Einfluss auf die Virus Replikation haben. Durch die Charakterisierung der GFP-exprimierenden Schweine IAV konnte ein wichtiger Beitrag zur Entwicklung Reporter-exprimierenden Viren geschaffen werden. Zusätzlich wurde 3-dimensionale Bildgebung für IAV-infizierte Mäuse Lungen durchgeführt. Hierbei wurde die tissue clearing Methode uDISCO (Pan et al., 2016) in Kombination mit einem Protokoll für Immunfluoreszenz (Renier et al., 2014) durchgeführt. Dabei wurden zwei verschiedene Antikörper gegen IAV getestet, einer welcher gegen IAV NP gerichtet war und ein weiterer welcher Zielstrukturen gegen das Vollvirus hat. Beide Antikörper zeigten sich als tauglich für die Detektierung der IAV Infektion in den 1 mm dicken Lungenschnitten. Es konnte sowohl die 3-dimensionale Verteilung des Virus im Gewebe als auch einzelne infizierte Zellen mit Hilfe von hoch auflösender konfokaler Laserscan Mikroskopie dargestellt werden. Damit und auch durch die Identifizierung eines ersten geeigneten Epithelzellmarkers konnte das uDISCO Protokoll erstmalig erfolgreich für die Detektion von IAV Infektion in Mäuselungen etabliert werden, wodurch die hier geleistete Arbeit einen wichtigen Beitrag für zukünftige Forschung in der Darstellung von IAV Infektionen in vivo darstellt.

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Ullrich, Stephanie: Generation and visualization of reporter gene expressing Influenza A viruses and visualization of influenza virus infection in murine lung tissue. Greifswald 2019. Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät.

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