Development and evaluation of double-attenuated influenza A live vaccines in swine

Mamerow, Svenja

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Development and evaluation of double-attenuated influenza A live vaccines in swine

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Swine influenza (SI) infections are observed frequently in pigs worldwide. This respiratory disease has a great economic relevance and bears high zoonotic risks. Novel pandemic strains in humans as in 2009 may emerge from pigs, serving as perpetual virus reservoir. Protection from conventional inactivated vaccines against SI depends heavily on a close match to circulating virus variants. Therefore, insufficient protection levels occur frequently in the field. Reverse genetics has become a common used method for the generation of alternative live-attenuated influenza vaccines (LAIV) targeting a cross-protective cell-mediated and humoral immunity against different IAV subtypes. Despite several promising LAIV approaches, there are still major safety issues regarding possible reversion or reassortment with circulating viruses. The present work describes the evaluation of a potential double-attenuated influenza live vaccine from the IAV A/Bayern/74/2009 (H1N1pdm09), generated by reverse genetics. Aiming at increased safety, the virus mutant By09-Ela/NS1-99 combines two attenuating features: (1) an artificial, strictly elastase-dependent hemagglutinin cleavage site and (2) a C-terminally truncated NS1 protein. This study describes its in vitro characterization but mainly focuses on the investigation in swine, as the target species, for determining attenuation and efficiency in a broad immunization and challenge trial. In vitro, the double-attenuated mutant replicated strictly elastase-dependently and could be used as a backbone strain carrying surface proteins from the important SI subtype H3N2. For in vivo experiments, pigs were vaccinated and challenged intranasally by a mucosal atomization device (MAD) which was evaluated as a suitable application method. After two immunizations, pigs were challenged with the homologous wild type A/Bayern/74/2009 (H1N1pdm09), homosubtypic A/Swine/Belzig/2/01 (H1N1), or heterosubtypic A/Swine/Bissendorf/IDT/1864/03 (H3N2) to address realistic challenge scenarios. Immunized pigs developed neither clinical symptoms nor detectable virus replication after homologous challenge. Additionally, we detected an increased serum antibody response and percentage of CD4+ T lymphocytes in the immunized animals indicating an efficient humoral immune response. Homosubtypically infected vaccinated animals showed considerably reduced clinical signs and no nasal virus shedding. After heterosubtypic challenge infection, reduced viral loads in respiratory tracts of the immunized animals were observed. Thus, a combination of both attenuation features can improve vaccine safety and still offers protection against homologous challenge and strong reduction of disease severity after the homosubtypic challenge infection. An optimized backbone strain may require less frequent updates with recent HA and NA genes and still induce strong protection in swine against drifted virus variants.

Influenza-A-Viren gehören weltweit zu den bedeutendsten respiratorischen Erregern in der modernen Schweinehaltung. Die Erkrankung hat neben einer hohen ökonomischen Bedeutung auch ein erhebliches zoonotisches Potenzial. Schweine gelten als Zwischenwirte für Reassortment- und Adaptationsprozesse von Influenza-A-Viren, wobei vermutet wird, dass diese Spezies eine Schlüsselfunktion zum Entstehen von pandemischen Virusvarianten in der menschlichen Bevölkerung einnehmen kann wie zuletzt im Jahre 2009. Die Effizienz inaktivierter Vakzinen gegen porzine Influenza basiert primär auf der engen Übereinstimmung der Impfstämme mit zirkulierenden Viren und Virusvarianten. Dementsprechend kommt es regelmäßig zu einem insuffizienten Schutz im Feld. Um eine breitere Immunantwort zu stimulieren und damit eine höhere Kreuzprotektivität zu erzielen, wurden mittels reverser Genetik in der Vergangenheit bereits einige attenuierte Lebendimpfstoffe experimentell getestet und evaluiert. Trotz vielversprechender Ergebnisse bestehen noch immer erhebliche Sicherheitsbedenken, die vor allem auf das Risiko einer möglichen Reversion der Impfstämme und auf das potentielle Reassortment mit zirkulierenden Feldstämmen zurückzuführen sind. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung doppelt-attenuierter Influenza-A-Lebendvakzinen, welche mittels reverser Genetik generiert wurden und auf dem pandemischen Influenza-A-Isolat A/Bayern/74/2009 (H1N1pdm09) basieren. Hierfür wurden zwei bereits etablierte Attenuierungsmerkmale kombiniert, um die Sicherheit der potentiellen Lebendvakzine zu erhöhen. Die Doppelmutante By09-Ela/NS1-99 trägt dementsprechend neben einem Elastase-abhängigen HA-Spaltstellen-Motiv zusätzlich ein C-terminal verkürztes NS1-Protein. Diese Studie beschreibt die In-Vitro-Charakterisierung und beinhaltet im Besonderen In-Vivo-Studien im Schwein als Zielspezies und natürlichen Wirt. Die durchgeführten Experimente untersuchen die Attenuierung sowie die Effizienz der doppelt attenuierten Virusmutante in einem breit gefassten Immunisierungs- und Belastungsversuch. Unsere In-Vitro-Studien konnten zeigen, dass die Doppelmutante ein strikt Elastase-abhängiges Wachstumsverhalten besitzt. Ebenfalls konnte By09-NS1-99 erfolgreich als Backbone-Stamm mit relevanten Oberflächenproteinen des Subtypen H3N2 kombiniert werden. In den durchgeführten In-Vivo Studien wurden Schweine zweifach intranasal mittels Mucosal Atomization Device (MAD) mit By09-Ela/NS1-99 immunisiert, wobei das MAD im Rahmen dieser Arbeit zuvor als passende Applikationsmethode evaluiert wurde. Die Doppelmutante war im Schwein stark attenuiert und wurde nicht ausgeschieden. Die Tiere wurden anschließend mit dem homologen Wildtyp A/Bayern/74/2009 (H1N1pdm09), dem homosubtypischen A/Swine/Belzig/2/2001 (H1N1) oder einem heterosubtypischen Isolat A/Swine/Bissendorf/IDT/1864/2003 (H3N2) infiziert. Nach homologer Belastungsinfektion zeigten die immunisierten Tiere weder klinische Symptome noch Virusreplikation im Respirationstrakt. Gesteigerte spezifische HA-Antikörper-Spiegel und ein erhöhter Prozentsatz an CD4+-T-Zellen nach Belastungsinfektion sprechen für eine effiziente humorale Immunantwort. Des Weiteren zeigten immunisierte Tiere nach homosubtypischer Belastungsinfektion verminderte klinische Symptome und keine nasale Virusausscheidung, während nach heterosubtypischer Infektion lediglich eine verringerte Viruslast in den Lungen der immunisierten Tiere beobachtet wurde. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass die Kombination beider Attenuierungsmerkmale die Sicherheit von attenuierten Influenza-A-Lebendvakzine erhöhen kann. Hierbei bietet eine Boost-Vakzinierung vollständigen Schutz gegenüber der homologen Belastungsinfektion und führt darüber hinaus zu einer erheblichen Reduktion der Krankheitssymptome nach homosubtypischer Infektion. Ein optimierter Backbone-Stamm bietet somit potentiell auch einen breiteren Schutz gegenüber Drift-Varianten innerhalb eines Influenza-A-Subtyps, so dass damit eine Aktualisierung der Vakzinestämme weniger oft notwendig ist.