Proteome analysis of chicken lymphocytes after infection and transformation by the oncogenic Marek’s disease virus

Das onkogene Alphaherpesvirus der Marek’schen Krankheit (MDV) verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie. Die wesentlichen Zielzellen einer natürlichen MDV Infektion sind primäre B- und T Lymphozyten. Die zytolytische Infektion von B Zellen führt zu deren Depletion und damit zu einer schweren Immunsuppression. Die Infektion von B Zellen führt auch zur Rekrutierung und Aktivierung von T Zellen. Die enge Interaktion zwischen B- und T Zellen ermöglicht die Übertragung von MDV zwischen den Lymphozyten. Während der Infektion von T Zellen bildet das Virus Latenz aus. Die Infektion der T Zellen kann zur Transformation und der Bildung von Lymphomen führen, die sich in verschiedenen viszeralen Organen manifestieren. Diese Studie zielt auf die Charakterisierung der Proteome von MDV-infizierten primären Lymphozyten während der lytischen und latenten Phase ab. Frühere in vitro Studien bezüglich der MDV-Pathogenese und der Virus-Wirt-Interaktionen wurden aufgrund der kurzen Lebensdauer primärer Lymphozyten in Zellkultur hauptsächlich auf primären Fibroblasten oder Nierenzellen durchgeführt. Vor kurzem wurde ein neues Zellkultursystem etabliert, welches die Lebensdauer der primären Lymphozyten durch die Zugabe von Zytokinen zum Zellkulturmedium verlängert. Dies ermöglichte die in vitro Infektion von B Zellen und die Durchführung quantitativer Proteomanalysen von primären Lymphozyten. Die Infektion mit GFP-markierten Virusrekombinanten erlaubte die Isolierung infizierter Zellen durch FACS vor der hier beschriebenen Proteomanalyse von MDV infizierten B Lymphozyten. Es wurde ein effizientes Protokoll zur quantitativen Analyse der Proteinexpression entwickelt. Dieses bestand aus einem Filter-gestützten (FASP) Verdau der extrahierten Proteine, gefolgt von der chemischen Einführung einer Isotopenmarkierung durch reduktive Dimethylierung der Peptide und anschließender LC-MALDI TOF/TOF massenspektrometrischen Analyse. Nach der Infektion der primären B Zellen mit dem sehr virulenten Stamm RB-1B und dem attenuierten Impfstamm CVI988/Rispens wurden nur wenige Änderungen in den Expressionsprofilen des Proteoms und des Transkriptoms beobachtet. Relevante Veränderungen der relativen Expressionsstärke der Proteine wurden für nur zwölf und sechs Wirtsproteine nach RB-1B- beziehungsweise CVI988-Infektion gefunden. Jedoch wurden die gleichen Proteine auch mit einer gleichsinnigen Regulierung in den Spektren der anderen Virusinfektion identifiziert. Die identifizierten Kandidaten spielen eine Rolle u.a. bei der Immunantwort, Translation und Entzündungsreaktion. Um die potenziellen Infektionsmarker zu bestätigen, wurde eine RNA-Sequenzierung von je drei biologischen Replikaten der einzelnen RB-1B-, CVI988- und scheininfizierten B Zellen durchgeführt. Achtzig MDV-Transkripte konnten identifiziert werden, die mit lytischen Infektionen assoziiert wurden. Die gleichen MDV-Proteine wurden nach einer Infektion mit RB-1B oder CVI988 identifiziert. Allerdings zeigten die Transkriptom- und Proteomanalysen von MDV-infizierten primären B Zellen eine schlechte Korrelation. Dies deutet darauf hin, dass die Veränderungen in der Proteinmenge vor allem auf posttranskriptionalen Ereignissen beruhen. Interessante Kandidaten wurden durch die RNA-Sequenzanalyse identifiziert, deren Transkriptmenge durch MDV-Infektion verändert waren. Nur wenige Änderungen wurden in dem Transkriptom der B Zellen nach MDV Infektion beobachtet, obwohl insgesamt fast 12.000 Transkripte identifiziert wurden. GO-Terme wie Immunantwort, apoptotische Prozesse, Signaltransduktion, Zellmigration und Antwort auf Virusinfektion wurden nach MDV Infektion angereichert. Die Ergebnisse der RNA-Seq bestätigen die oben genannten Beobachtungen der geringfügigen Änderungen durch MDV in dem zellularen Proteom während lytischer Infektion. MDV induziert die Transformation von Lymphozyten, was zu bösartigen T Zelllymphomen in viszeralen Organen führt und mit einer Mortalität von bis zu 100% einhergehen kann. Während schon mehrere Faktoren identifiziert wurden, die bei der MDV-induzierten Tumorentstehung eine Rolle spielen, ist der Transformationsprozess nicht vollständig verstanden. Diese Wissenslücke sollte mit einer ex vivo Proteomanalyse der transformierten T Zellen gefüllt werden. Darüber hinaus sollte die Rolle der viralen Telomerase RNA während der Transformation durch den Vergleich von Tumoren, die nach der Infektion mit WT-Virus oder einer Telomerase RNA negativen Mutante gebildet wurden, aufgeklärt werden. Ein großes Hindernis für Proteomanalysen von Tumoren ist die Gewinnung ausreichender Mengen an homogenem Tumorgewebe, da die Tumore in den betroffenen Organen disseminiert vorliegen. Die Quantifizierung der Zelltypen ergab schon beim gleichen Tumortyp stark streuende Anteile von Hepatozyten, Bindegewebe und CD3 + Lymphozyten in Proben aus verschiedenen Tieren. Makroskopische Präparate von Tumoren enthalten Kontaminationen von infiltrierendem gesundem Gewebe und die daraus resultierenden Proteomanalysen weisen eine niedrige Sensitivität auf. Da die vTR Tumore, trotz der Streuung den geringeren Leberzellanteil und höheren T-Zell Anteil zu haben schienen, wurde deren Analyse vorangestellt. So wurden ∆vTR Tumore zur Analyse von Proteinexpressionsprofil von Tumoren und naiven T Zellen verwendet. Dazu wurde ein Analysengang für die Proteomanalyse von reinen T Zelltumoren aus der Leber von MDV-infizierten Hühnern entwickelt. Zu den Proben gehörten mikrosezierte Gewebeschnitte von Tumoren und umliegendem gesunden Lebergewebe, sowie naive T Zellen, die aus Hühnerblut isoliert wurden. Um eine quantitative Proteomanalyse zu ermöglichen, wurden Proben mit dem FASP-Protokoll verdaut und die Peptide durch differentieller Dimethylmarkierung Isotopen-kodiert. Zur Verbesserung der Proteomanalyse wurden Peptide durch eine präparative isoelektrischen Fokussierung vor der Analyse durch Nano-HPLC MALDI/TOF-TOF Massenspektrometrie fraktioniert. Proteinanalysen von LCM-sezierten ΔvTR Tumoren im Vergleich zu naiven T Zellen, den Zielzellen der Transformation, identifizierten neunzehn potenzielle Transformationsmarker. Generell wurden wieder nur wenige Änderungen in der relativen Expressionsstärke der Proteine beobachtet. Mehrere der identifizierten Marker konnten auch durch eine RT-qPCR auf Transkriptebene verifiziert werden. Die identifizierten Transformationskandidaten werden laut Gene Ontology Datenbank mit dem Aufbau des Nukleosoms, der Regulation der Transkription, entzündlicher Reaktion, Immunantwort und Oxidations-Reduktions-Reaktion assoziiert. Allerdings müssen weitere funktionelle Analysen durchgeführt werden, um die Rolle der identifizierten Marker während der MDV-Infektion und-Transformation vollständig zu klären.