Isolierung, In-vitro-Kultivierung und Charakterisierung von porzinen und bovinen ovariellen Stammzellen

Im Gegensatz zum männlichen Geschlecht, galt es lange Zeit als unumstritten, dass weibliche Säugetiere mit einer festen Anzahl an Keimzellen geboren werden und dass im Laufe des weiteren Lebens keine neuen mehr hinzukommen. Neueste Studien haben Hinweise ergeben, dass es in murinen und humanen Ovarien sogenannte ovarielle Stammzellen gibt. Es handelt sich hierbei um mitotisch aktive Keimbahnstammzellen, die homolog zu den spermatogonialen Stammzellen im Hoden sind und auch noch postnatal zu Eizellen differenzieren können. Eine Transplantation dieser Zellen könnte neue Therapieansätze zur Erhaltung der ovariellen Funktion und Fertilität eröffnen und somit der Humanmedizin von großem Nutzen sein. Auch der Einsatz in der Tierzucht und somit eine frühe genomische Selektion bei wertvollen Tieren könnte durch diese Zellen ermöglicht werden. Da die bisher gewonnenen Erkenntnisse über ovarielle Stammzellen hauptsächlich in der Maus gemacht wurden, sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob diese Zellen auch in anderen Spezies wie Schwein und Rind existieren. Porzine und bovine ovarielle Stammzellen sollten isoliert, in vitro kultiviert und charakterisiert werden. Für diesen Zweck wurden zunächst zwei verschiedene Vereinzelungsmethoden (nach HONARAMOOZ et al. 2002 und nach WOODS und TILLY 2013) zur enzymatischen Zersetzung von porzinem und bovinem ovariellem Gewebe und zusätzlich zwei Kollagenasetypen in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (400U/ml oder 800U/ml) getestet. Aufgrund von signifikanten Unterschieden bei der Vitalität der gewonnenen Zellen, wurde die modifizierte Vereinzelungsmethode nach WOODS und TILLY (2013) als besser befunden. Bei den darauffolgenden Tests von zwei Kollagenasetypen (TYP II und IV) ergaben sich keine Vitalitätsunterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Aufgrund von signifikant höheren Gesamtzellzahlen der gewonnenen Zellen, wurde eine Enzymkonzentration von 800U/ml als effizienter eingestuft. Da es keine Unterschiede zwischen den Kollagenasetypen bei gleicher Konzentration gab, wurde für weitere Versuche die Kollagenase Typ II verwendet, die auch für die Vereinzelung anderer Gewebetypen im Marienseer Labor standardmäßig eingesetzt wird. Im zweiten Teil der Arbeit sollten Vasa- und Fragilis-positive Zellen aus Ovargewebe isoliert werden. Dafür wurde zuerst die Expression der beiden Marker in porzinen und bovinen ovariellen Gesamtzellsuspensionen mittels Immun-fluoreszenzfärbung überprüft. Als Kontrolle wurden murine ovarielle Zellen verwendet. Durch Konfokalmikroskopie konnten bei allen drei Spezies einzelne Zellen mit oberflächlicher Vasa- bzw. Fragilis-Expression nachgewiesen werden. Mit durchflusszytometrischen Messungen konnten 2,8% Vasa-positive Zellen in porzinen, 3,1% in bovinen und 1,5% in murinen ovariellen Gesamtzellsuspensionen detektiert werden. Eine Fragilis-Expression konnte in 1,4% der porzinen, in 1,5% der bovinen und in 1,4% der murinen ovariellen Zellen nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurden porzine und bovine ovarielle Zellen aufgrund ihrer VASA- bzw. FRAGILIS-Proteinexpression mit Hilfe des Magnetic-activated cell sortings (MACS) angereichert. Auch hier wurden murine ovarielle Zellen als Kontrolle verwendet. Die positiv und negativ selektierten Zellfraktionen wurden zum einen direkt nach Selektion auf Expression von Keimzellmarkern (VASA, FRAGILIS, PRDM1, ZP3) mittels RT-qPCR analysiert (nur porzine und bovine Zellfraktionen), um die Effizienz der Anreicherung zu überprüfen. Zum anderen wurden die Zellfraktionen aller drei Spezies in verschiedenen Zellkulturmedien in vitro kultiviert. Die als Kontrolle verwendeten murinen Zellen wurden in MEM-a als Standardmedium kultiviert. Die porzinen und bovinen Zellen wurden in MEM-a und DMEM kultiviert. Zusätzlich wurden die bovinen Zellen in konditioniertem MEM-a und in mTeSR1 mit und ohne Zusätzen kultiviert. Bei der Analyse der Expression der oben genannten Keimzellmarker auf mRNA-Ebene, konnte eine fünffache Anreicherung VASA-positiver Zellen in den selektierten porzinen Zellfraktionen nachgewiesen werden. Signifikante Unterschiede wurden auch bei der Expression von PRDM1 nachgewiesen. Im Gegensatz zur Anreicherung mit VASA, war die Anreicherung mit FRAGILIS als Selektionsmarker weniger effizient. Nur bei der Expression von VASA konnte in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen ein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Bei der VASA-Selektion boviner Zellen konnte im Vergleich zum Schwein, nur eine 1,5fache Anreicherung VASA-positiver Zellen in den selektierten Zellfraktionen nachgewiesen werden. Es gab keine Unterschiede in der Expression der anderen Keimzellmarker. Interessant ist, dass, im Vergleich zu den porzinen Zellen, die ZP3-Expression in den bovinen Zellfraktionen relativ hoch war, was auf ein mögliches Vorhandensein von Eizellen bzw. kleineren Eizellvorläufern in den Zellfraktionen hinweist. Bei den bovinen Zellen konnte keine Anreicherung mit FRAGILIS als Selektionsmarker erreicht werden. Es konnte kein Unterschied in der FRAGILIS-Expression zwischen den FRAGILIS-positiv und FRAGILIS-negativ selektierten Zellfraktionen nachgewiesen werden. Aufgrund von geringen poly(A)-RNA-Mengen, konnte die Expression von VASA, PRDM1 und ZP3 in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen nicht detektiert werden. Deswegen war bei diesen Genen kein Vergleich der Zellfraktionen möglich. Im letzten Teil der Arbeit wurden die mittels MACS angereicherten porzinen, bovinen und murinen Zellfraktionen in verschiedenen Kulturmedien in vitro kultiviert. Bei den als Kontrolle verwendeten murinen Zellen, konnten runde Zellen sowohl in den mit Vasa als auch in den mit Fragilis selektierten Zellfraktionen beobachtet werden. Während die Zellen der Vasa-positiv selektierten Fraktionen nach einiger Zeit Kolonien formten und bis Passage 3 kultiviert wurden, blieben die Fragilis-positiv selektierten Zellen vereinzelt und proliferierten nicht weiter. Beim Schwein konnten in den VASA-positiv selektierten Zellfraktionen zwei morphologisch unterschiedliche, helle und dunklere Zelltypen in DMEM beobachtet werden, während in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen nur die dunkleren Zellen beobachtet werden konnten. Bei den bovinen VASA- und FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen konnten runde Zellen nur in mTeSR1-Medium mit Zusätzen beobachtet werden. Während die VASA-positiv selektierten Zellen traubenartige Kolonien formten, blieben die FRAGILIS-positiv selektierten Zellen eher vereinzelt. Es ist nicht gelungen, die Zellen weiter zu vermehren und Langzeitkulturen zu etablieren. Nach etwa dreiwöchiger In-vitro-Kultivierung wurde die Expression der Vasa- und Fragilis-Proteine in den selektierten Zellfraktionen aller drei Spezies mittels Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Bei allen drei Spezies konnten Vasa- und Fragilis-exprimierende Zellen nicht detektiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Etablierung porziner und boviner ovarieller Stammzellen. Die Anreicherung mittels Magnetic-activated cell sorting und die In-vitro-Kultivierung dieser Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen gibt erste Anhaltspunkte für weiterführende Untersuchungen. Unter anderem ist es notwendig, weitere Selektionsmarker für ovarielle Stammzellen bei Nutztieren zu untersuchen. Außerdem wäre es von großem Vorteil, die Anreicherung von ovariellen Stammzellen mit weiteren Methoden zu prüfen, um reine Populationen zu isolieren und das Überwachsen mit somatischen Zellen zu verhindern.