Isolierung, In-vitro-Kultivierung und Charakterisierung von porzinen und bovinen ovariellen Stammzellen

Röttinger, Irene GND

Im Gegensatz zum männlichen Geschlecht, galt es lange Zeit als unumstritten, dass weibliche Säugetiere mit einer festen Anzahl an Keimzellen geboren werden und dass im Laufe des weiteren Lebens keine neuen mehr hinzukommen. Neueste Studien haben Hinweise ergeben, dass es in murinen und humanen Ovarien sogenannte ovarielle Stammzellen gibt. Es handelt sich hierbei um mitotisch aktive Keimbahnstammzellen, die homolog zu den spermatogonialen Stammzellen im Hoden sind und auch noch postnatal zu Eizellen differenzieren können. Eine Transplantation dieser Zellen könnte neue Therapieansätze zur Erhaltung der ovariellen Funktion und Fertilität eröffnen und somit der Humanmedizin von großem Nutzen sein. Auch der Einsatz in der Tierzucht und somit eine frühe genomische Selektion bei wertvollen Tieren könnte durch diese Zellen ermöglicht werden. Da die bisher gewonnenen Erkenntnisse über ovarielle Stammzellen hauptsächlich in der Maus gemacht wurden, sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob diese Zellen auch in anderen Spezies wie Schwein und Rind existieren. Porzine und bovine ovarielle Stammzellen sollten isoliert, in vitro kultiviert und charakterisiert werden. Für diesen Zweck wurden zunächst zwei verschiedene Vereinzelungsmethoden (nach HONARAMOOZ et al. 2002 und nach WOODS und TILLY 2013) zur enzymatischen Zersetzung von porzinem und bovinem ovariellem Gewebe und zusätzlich zwei Kollagenasetypen in zwei unterschiedlichen Konzentrationen (400U/ml oder 800U/ml) getestet. Aufgrund von signifikanten Unterschieden bei der Vitalität der gewonnenen Zellen, wurde die modifizierte Vereinzelungsmethode nach WOODS und TILLY (2013) als besser befunden. Bei den darauffolgenden Tests von zwei Kollagenasetypen (TYP II und IV) ergaben sich keine Vitalitätsunterschiede zwischen den Behandlungsgruppen. Aufgrund von signifikant höheren Gesamtzellzahlen der gewonnenen Zellen, wurde eine Enzymkonzentration von 800U/ml als effizienter eingestuft. Da es keine Unterschiede zwischen den Kollagenasetypen bei gleicher Konzentration gab, wurde für weitere Versuche die Kollagenase Typ II verwendet, die auch für die Vereinzelung anderer Gewebetypen im Marienseer Labor standardmäßig eingesetzt wird. Im zweiten Teil der Arbeit sollten Vasa- und Fragilis-positive Zellen aus Ovargewebe isoliert werden. Dafür wurde zuerst die Expression der beiden Marker in porzinen und bovinen ovariellen Gesamtzellsuspensionen mittels Immun-fluoreszenzfärbung überprüft. Als Kontrolle wurden murine ovarielle Zellen verwendet. Durch Konfokalmikroskopie konnten bei allen drei Spezies einzelne Zellen mit oberflächlicher Vasa- bzw. Fragilis-Expression nachgewiesen werden. Mit durchflusszytometrischen Messungen konnten 2,8% Vasa-positive Zellen in porzinen, 3,1% in bovinen und 1,5% in murinen ovariellen Gesamtzellsuspensionen detektiert werden. Eine Fragilis-Expression konnte in 1,4% der porzinen, in 1,5% der bovinen und in 1,4% der murinen ovariellen Zellen nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurden porzine und bovine ovarielle Zellen aufgrund ihrer VASA- bzw. FRAGILIS-Proteinexpression mit Hilfe des Magnetic-activated cell sortings (MACS) angereichert. Auch hier wurden murine ovarielle Zellen als Kontrolle verwendet. Die positiv und negativ selektierten Zellfraktionen wurden zum einen direkt nach Selektion auf Expression von Keimzellmarkern (VASA, FRAGILIS, PRDM1, ZP3) mittels RT-qPCR analysiert (nur porzine und bovine Zellfraktionen), um die Effizienz der Anreicherung zu überprüfen. Zum anderen wurden die Zellfraktionen aller drei Spezies in verschiedenen Zellkulturmedien in vitro kultiviert. Die als Kontrolle verwendeten murinen Zellen wurden in MEM-a als Standardmedium kultiviert. Die porzinen und bovinen Zellen wurden in MEM-a und DMEM kultiviert. Zusätzlich wurden die bovinen Zellen in konditioniertem MEM-a und in mTeSR1 mit und ohne Zusätzen kultiviert. Bei der Analyse der Expression der oben genannten Keimzellmarker auf mRNA-Ebene, konnte eine fünffache Anreicherung VASA-positiver Zellen in den selektierten porzinen Zellfraktionen nachgewiesen werden. Signifikante Unterschiede wurden auch bei der Expression von PRDM1 nachgewiesen. Im Gegensatz zur Anreicherung mit VASA, war die Anreicherung mit FRAGILIS als Selektionsmarker weniger effizient. Nur bei der Expression von VASA konnte in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen ein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Bei der VASA-Selektion boviner Zellen konnte im Vergleich zum Schwein, nur eine 1,5fache Anreicherung VASA-positiver Zellen in den selektierten Zellfraktionen nachgewiesen werden. Es gab keine Unterschiede in der Expression der anderen Keimzellmarker. Interessant ist, dass, im Vergleich zu den porzinen Zellen, die ZP3-Expression in den bovinen Zellfraktionen relativ hoch war, was auf ein mögliches Vorhandensein von Eizellen bzw. kleineren Eizellvorläufern in den Zellfraktionen hinweist. Bei den bovinen Zellen konnte keine Anreicherung mit FRAGILIS als Selektionsmarker erreicht werden. Es konnte kein Unterschied in der FRAGILIS-Expression zwischen den FRAGILIS-positiv und FRAGILIS-negativ selektierten Zellfraktionen nachgewiesen werden. Aufgrund von geringen poly(A)-RNA-Mengen, konnte die Expression von VASA, PRDM1 und ZP3 in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen nicht detektiert werden. Deswegen war bei diesen Genen kein Vergleich der Zellfraktionen möglich. Im letzten Teil der Arbeit wurden die mittels MACS angereicherten porzinen, bovinen und murinen Zellfraktionen in verschiedenen Kulturmedien in vitro kultiviert. Bei den als Kontrolle verwendeten murinen Zellen, konnten runde Zellen sowohl in den mit Vasa als auch in den mit Fragilis selektierten Zellfraktionen beobachtet werden. Während die Zellen der Vasa-positiv selektierten Fraktionen nach einiger Zeit Kolonien formten und bis Passage 3 kultiviert wurden, blieben die Fragilis-positiv selektierten Zellen vereinzelt und proliferierten nicht weiter. Beim Schwein konnten in den VASA-positiv selektierten Zellfraktionen zwei morphologisch unterschiedliche, helle und dunklere Zelltypen in DMEM beobachtet werden, während in den FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen nur die dunkleren Zellen beobachtet werden konnten. Bei den bovinen VASA- und FRAGILIS-positiv selektierten Zellfraktionen konnten runde Zellen nur in mTeSR1-Medium mit Zusätzen beobachtet werden. Während die VASA-positiv selektierten Zellen traubenartige Kolonien formten, blieben die FRAGILIS-positiv selektierten Zellen eher vereinzelt. Es ist nicht gelungen, die Zellen weiter zu vermehren und Langzeitkulturen zu etablieren. Nach etwa dreiwöchiger In-vitro-Kultivierung wurde die Expression der Vasa- und Fragilis-Proteine in den selektierten Zellfraktionen aller drei Spezies mittels Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Bei allen drei Spezies konnten Vasa- und Fragilis-exprimierende Zellen nicht detektiert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Etablierung porziner und boviner ovarieller Stammzellen. Die Anreicherung mittels Magnetic-activated cell sorting und die In-vitro-Kultivierung dieser Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen gibt erste Anhaltspunkte für weiterführende Untersuchungen. Unter anderem ist es notwendig, weitere Selektionsmarker für ovarielle Stammzellen bei Nutztieren zu untersuchen. Außerdem wäre es von großem Vorteil, die Anreicherung von ovariellen Stammzellen mit weiteren Methoden zu prüfen, um reine Populationen zu isolieren und das Überwachsen mit somatischen Zellen zu verhindern.

A dogma in biology implies, that female mammals are born with a fixed number of germ cells, which is not replenished over time. Recent studies have indicated that a small amount of ovarian stem cells is present in mouse and human ovaries. These are mitotically active germline stem cells, which are homologous to spermatogonial stem cells in the testes and are able to differentiate into oocytes postnatally. Transplantation of these ovarian stem cells could bring about new therapies for the maintenance of ovarian function and fertility and thereby could be useful for human medicine. The goal of the present study was to demonstrate the presence of ovarian stem cells in pigs and cattle. Porcine and bovine ovarian stem cells should be isolated, cultured in vitro and characterized. Two different dissociation methods (modified from HONARAMOOZ et al. 2002 and modified from WOODS and TILLY 2013) were initially tested for dispersion of porcine and bovine ovarian tissue. Additionally, two types of collagenase treatments, each in two different concentrations (400 U/ml or 800 U/ml) were tested in their efficiency to yield high enough numbers of viable ovarian cells. Due to significant differences in viability of the obtained cells, the modified method by WOODS and TILLY (2013) was significantly more efficient compared to the method modified by HONARAMOOZ et al. (2002) and was selected as standard treatment for subsequent experiments. No differences were found between the two types of collagenases (Type II and IV) regarding cell viability. The higher enzyme concentration yielded significantly more ovarian cells. Thus, collagenase type II, which is also used for dispersion of tissues in the Mariensee laboratory, was employed for the following experiments. As a next step, Vasa- and Fragilis-positive cells were isolated from ovarian tissue. Expression of both markers in porcine and bovine ovarian cell suspensions was analyzed with immunostaining. Murine ovarian cells served as control. Single cells positive for surface expression of Vasa and Fragilis could be detected in all three species. Flow cytometric analysis revealed that 2.8 % of porcine, 3.1 % of bovine and 1.5 % of murine ovarian cells were Vasa-positive. Fragilis expression was detected in 1.4 % of porcine, in 1.5 % of bovine and in 1.4% of murine ovarian cells. Next, VASA- and FRAGILIS-positive porcine and bovine ovarian cells were enriched via Magnetic-activated cell sorting (MACS). Murine ovarian cells were used as control. Positive and negative cell fractions were analyzed for expression of a panel of germline markers (VASA, FRAGILIS, PRDM1, ZP3) (in pig and cattle only) with RT-qPCR in order to verify efficiency of the enrichment. Moreover, cell fractions of all three species were cultured in vitro in different cell culture media. Murine cells were cultured in MEM-a as reference medium as control. Porcine and bovine cells were cultured in MEM-a or DMEM. Additionally, bovine cells were cultured in conditioned MEM-a or in mTeSR1 with and without supplements. Expression analysis revealed a fivefold enrichment of VASA-positive cells in the selected porcine cell fractions. Significant differences were also detected in the expression of PRDM1 between VASA-positive and VASA-negative cell fractions. In contrast to VASA-positive cells, enrichment of FRAGILIS positive porcine cells, was less efficient. Only expression of VASA was significantly higher in the FRAGILIS-positive cells compared to FRAGILIS-negative counterparts. In cattle, a 1,5-fold enrichment was observed in VASA-selected cells. No differences were detected with regard to expression of other germline markers in bovine cell fractions. Interestingly, the expression of ZP3 in bovine cells was relatively high compared to porcine cells, indicating the existence of oocytes or small oocyte precursors in the cell fractions. In contrast to porcine cells, no enrichment with FRAGILIS as selection marker was obtained in bovine cells. Moreover, no difference in the expression of FRAGILIS was detected between FRAGILIS-positive and FRAGILIS-negative bovine cell fractions. Due to the minimum amounts of poly(A)-RNA, expression of VASA, PRDM1 and ZP3 could be not detected in the FRAGILIS-positive cell fractions. Thus, gene expression profiles could not be compared between cell fractions. In the final part of the thesis, MACS enriched bovine, porcine and murine cells were cultured in vitro in different cell culture media. In murine cells, which were used as control, round cells were observed in both, Vasa- and Fragilis-selected cell fractions after weeks of culture. Cells in the Vasa-positive fractions formed colonies and could be maintained until passage 3. Fragilis-positive cells remained isolated and did not proliferate. Porcine VASA-positive cells cultured in DMEM contained two morphologically different cell types, a bright and a dark cell type. In FRAGILIS-positive cell fractions only dark type colonies could be observed. In bovine VASA- and FRAGILIS-positive cell fractions round cells were exclusively observed in mTeSR1 medium with supplements. While VASA-positive cells formed grape-shaped colonies, the FRAGILIS-positive cells remained as single cells. It was not possible to culture the cells for more than a few weeks. After three weeks of in vitro culture, expression of Vasa and Fragilis proteins was analyzed in the selected cell fractions of all three species via immunostaining. Vasa- and Fragilis-expressing cells were not detected in all three species. In conclusion, results of the present study illustrate the difficulties in isolating and establishing porcine and bovine ovarian stem cells. The enrichment with Magnetic-activated cell sorting and the in vitro culture data provide important hints for further experiments. It is still necessary to explore other selection markers for ovarian stem cells in farm animals. Moreover, it would be a beneficial to develop alternative methods for isolating ovarian stem cell populations in order to gain pure cell populations and to minimize overgrowth by somatic cells.

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Röttinger, Irene: Isolierung, In-vitro-Kultivierung und Charakterisierung von porzinen und bovinen ovariellen Stammzellen. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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