Quantitative analysis of the antigenicity of xenogeneic heart valve matrices using individual human sera

Ralle, Isabel GND

Dezellularisierte Allografts stellen derzeit die beste Herzklappenprothese in der Kinderherzchirurgie dar. Aufgrund der eingeschränkten Verfügbarkeit der humanen Spenderklappen, stellen Xenografts eine attraktive Alternative dar, vorausgesetzt die erhöhte Antigenität der xenogenen Klappen kann umgangen werden. Die starke Antigenität wird durch Xenoantigene ausgelöst, welche sowohl präformierte, als auch induzierte Antikörper binden können. Diese Antikörper lösen Immunreaktionen aus, die bis zur Abstoßung des Implantates führen können. Um die immunogenen Epitope zu reduzieren, werden neue Konzepte der Dezellularisierung und der genetischen Modifizierung von Schweinen als Organspender entwickelt. Dadurch konnte bereits das bekannte Xenoantigen alpha-gal eliminiert werden und damit die hyperakute Abstoßreaktion vermieden werden. Es wird allerdings davon ausgegangen, dass die meisten anderen Xenoantigene, die zu einer akuten Abstoßreaktion führen können, bislang noch nicht identifiziert werden konnten. Ein Test, der die Bindung von präformierten Antikörpern an diese Xenoantigene detektieren kann, um die Reduktion der Antigenität von Transplantaten zu ermitteln und um Immunreaktionen vor einer Transplantation vorhersagen zu können, ist daher wünschenswert. Die Entwicklung eines solchen Tests war das Ziel der vorliegenden Arbeit. Um die Bindung von präformierten Antikörpern zu ermitteln, wurde porcines, dezellularisiertes Herzklappengewebe in Lösung gebracht, um damit eine Membran zu beladen, die mit menschlichem Serum inkubiert wurde. Die Bindung präformierter Antikörper wurde daraufhin mittels sekundärer Antikörper spezifisch für humane Immunglobuline detektiert. Bei der Verwendung von dezellularisiertem Wildtyp (WT) oder GGTA1 knockout (KO) Herzklappenmaterial konnte mit dem Test ein signifikanter Unterschied in der Bindung präformierter Antikörper festgestellt werden. In WT Gewebe führte das vorhandene alpha-gal Epitop trotz vorheriger Dezellularisierung der Herzklappen zu einer erheblichen Antikörperbindung. Bei alpha-gal defizienten Schweineklappen wurden im Vergleich erheblich weniger Antikörper gebunden. Die Menge der gebundenen präformierten Antikörper war abhängig sowohl von der individuellen Herzklappe, als auch vom individuellen humanen Serum. Dies deutet darauf hin, dass die Menge der präformierten Antikörper in menschlichen Seren individuell unterschiedlich ist und von der vorangegangenen Exposition zu den jeweiligen Epitopen abhängt. Die Testung von humanen Allografts wurde durch die Bindung vom sekundären Antikörper erschwert, so dass die Signalstärke der humanen Proben und damit die Bindung von präformierten Antikörpern, nicht ausgewertet und interpretiert werden konnte. Die hier entwickelte Methode kann nicht nur für die Messung der Reduktion der Antigenität von Herzklappengewebe im Labor verwendet werden, sondern auch für die Selektion von Versuchstieren für in vivo Experimente. Die Zahl der Versuchstiere könnte reduziert werden, indem Serum von Empfängertieren an verschiedenen Spenderklappen anderer Spezies getestet wird. Darüber hinaus kann mit Hilfe dieses Tests eine Verlaufskontrolle bei Tierversuchen erfolgen, indem die Menge der Antikörper der Empfängertiere zu unterschiedlichen Zeitpunkten kontrolliert wird. Wenn die Aussagekraft der Vorhersagen mit diesem Test durch Tierexperimente bestätigt werden kann, dann könnte dieser Test in Zukunft auch dafür genutzt werden, die am besten geeignete Herzklappenprothese tierischen Ursprungs für Menschen auszusuchen. Herzklappen gegen die der Empfänger bereits präformierte Antikörper aufweist, könnten dann ausgeschlossen und das Risiko einer Abstoßung vermindert oder sogar verhindert werden.

Decellularized allografts represent the state of the art in terms of pulmonary heart valve substitutes for children. However, the allografts are short in supply. Thus, xenografts represent an appealing alternative once the problem of antigenicity is solved. The strong antigenicity is caused by xenoantigens which attract preformed and induced antibodies, triggering immune responses that can lead to graft rejection. In terms of reducing immunogenic epitopes on xenografts, new concepts of decellularization and methods for the generation of genetically modified pigs as heart valve donors are increasingly yielding promising results. The hyperacute rejection can be prevented by elimination of the best known xenoantigen alpha-gal. It is assumed, that most xenoantigens remain as yet unidentified, which can lead to acute graft rejection. A method detecting preformed antibody binding to matrices in vitro is required to evaluate the reduction of xenoantigens after applying different treatments and to predict immunological reactions prior to transplantation. The development of such a method was the aim of this thesis. In order to detect preformed antibody binding, decellularized porcine heart valve material was solubilized and loaded on a membrane which was incubated with different human sera. Preformed antibody binding was detected using a secondary antibody specific for human immunoglobulins. The test system revealed significant differences of preformed antibody binding and allowed to detect high binding to decellularized porcine WT heart valves compared to low binding to decellularized matrices from GGTA1 knockout pigs. The quantity of preformed antibody binding was dependent on the individual heart valve matrices and the individual human sera. This indicates that the amount of preformed antibodies varies in humans and could be dependent on individual pre-exposure to certain xenoantigens. Testing human allograft matrices was hampered by secondary antibody binding to the matrix which impeded the interpretation of the measured signal intensity. The developed method cannot only be used to measure the reduction of antigenicity in a laboratory setting, it can also be used as a preselection tool for in vivo studies. In order to reduce the numbers of experimental animals needed, animal sera of recipient animals could be exposed to donor tissue of another species as a preselection tool, in order to prevent acute graft rejection. The test can also be employed as a monitoring tool during in vivo studies, using blood samples at different time points to detect changes in antibody titers of the recipient. When the prediction outcome is verified by animal studies, it may also be used in a clinical setting as a pre-transplantation tool to preselect a xenogeneic donor heart valve for each human recipient in need of a donor organ, to prevent graft rejection caused by preformed antibodies.

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Ralle, Isabel: Quantitative analysis of the antigenicity of xenogeneic heart valve matrices using individual human sera. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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