Strategie zur Erstellung eines Fanconi-Anämie Modells im Schwein mittels Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)

Apfelbaum, Ronja

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Strategie zur Erstellung eines Fanconi-Anämie Modells im Schwein mittels Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)

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Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene rezessive Erkrankung des Menschen, die bei ca. einer von 100000 Geburten auftritt. Dabei kommt es neben einer kleinen Statur, zu verschiedenen Geburtsfehlern, einer erhöhten Tumorentstehung und zum Knochenmarksversagen. Verantwortlich dafür sind unterschiedliche Mutationen in einem der FA-Gene. Am häufigsten betroffen ist hierbei das FANCA-Gen. 60-70% der Erkrankten haben eine Mutation in diesem Genlocus. Die Mutationen führen zu einer verminderten oder nicht vorhandenen Expression des FANCA-Proteins. Dieses ist Bestandteil im sogenannten Fanconi-Reparaturmechanismus. In diesem Mechanismus aktiviert der Fanconi-Kernkomplex eine Reparaturkaskade, um Interstrand-Crosslinks (ICL) zu reparieren. Bei einer Mutation im FANCA-Gen wird der Fanconi-Kernkomplex nicht vollständig gebildet und ICLs der DNA nicht repariert. Dadurch kommt es zu Problemen bei der DNA-Replikation. Besonders auffällig ist dies bei sich stark replizierenden Zellen, z.B. den hämatopoetischen Stammzellen. Die durchschnittliche Lebenserwartung von unbehandelten Erkrankten liegt bei ca. 24 Jahren. Die Therapiemöglichkeiten sind begrenzt, das Knochenmarkversagen kann durch eine Knochenmarktransplantation behandelt werden. Für nachfolgende Symptome, wie die Ausbildung von Tumoren, gibt es derzeit keine Therapie. Die bisherigen Mausmodelle haben auch ihre Grenzen, da sie die phänotypischen Merkmale nur begrenzt aufweisen und insbesondere das Knochenmarksversagen nicht entwickeln. Aus diesem Grund fokussiert sich diese Arbeit auf die Generierung eines FANCA-Models in porzinen Zellen und parthenogenetischen Embryonen, da das Schwein in der Physiologie und Pathologie dem Menschen sehr ähnlich ist. Dafür wurde das CRISPR/Cas9-System verwendet. Dieses System ermöglicht es, gezielt an einer Position in Genom Doppelstrangbrüche herbeizuführen. Diese werden mittels nicht-homologer Endverknüpfung (NHEJ) repariert, was oft zur Insertionen und Deletionen (INDELs) führt. In dieser Arbeit wurden spezifische CRISPR/Cas9-Genscheren für die Exone 7, 9 und 10 des FANCA-Gen des Schweins entwickelt. Es wurden verschiedene Zelltypen untersucht, darunter immortalisierte STE-Zellen, porzine induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) und parthenogenetische porzine Embryonen. Es hat sich gezeigt, dass INDELs in allen drei Zelltypen gebildet werden konnten. Dabei war dies in den STE-Zellen und Embryonen erfolgreicher als in den iPS-Zellen. Zudem zeigte sich eine leichte Tendenz, dass eine INDEL-Bildung in den Exonen 7 und 10 einfacher zu generieren ist, als in Exon 9. Diese Arbeit ist ein vielversprechender Anfang für die Erstellung eines FANCA-Schweinemodells, um mögliche Therapien evaluieren zu können.

The Fanconi anemia (FA) is a rare human disease, with a prevalence of one of 100 000 births. Phenotypic symptoms are a short stature, malformations and a bone marrow failure. Responsible for the disease are different mutations in one of the FA genes. Most often, the FANCA gene is mutated in 60-70% of all patients. The disease occurring mutations lead to a reduced or absent expression of the FANCA protein, which is part of the Fanconi core complex of the Fanconi repair pathway. In this pathway, the core complex activates the repair cascade of interstrand crosslinks (ICL). In case of a mutation in the FANCA gene the FA core complex is not completely active and ICLs will not be repaired. This leads to problems during the DNA replication. Most susceptible are highly replicative cells, such as the hematopoietic stem cells. The mean life expectancy of untreated FA patients is about 24 years. Currently, the therapeutic options are limited, and the bone marrow failure may be treated by a bone marrow transplantation. For other symptoms, like the enhanced tumour formation, no specific therapies are available. Existing mouse models of the Fanconi anemia are not mimicking the phenotype, particularly not the bone marrow failure. This study focusses on the generation of a FA model in porcine cells and parthenogenetic embryos, because of the high similarity between the human and porcine physiology and pathology. For this purpose, the molecular scissor CRISRP/Cas9 has been used. With this molecular scissor it is possible to introduce a specific double strand break in a genome. Double strand breaks will be repaired via non-homologous end-joining (NHEJ), which is error prone and often leads to insertions and deletions (INDELs). In this work, specific CRISPR/Cas molecules targeting the FANCA exons 7, 9 and 10 have been developed. This study shows that it is possible to introduce INDELs in cells and embryos using the CRISPR/Cas9 system. The INDEL formation efficiency was slightly more efficient in STE cells and embryos than in iPS cells. Furthermore, the tendency to introduce INDELs seems to be more efficient in the exons 7 and 10. Nevertheless, this study is a promising baseline for the production of a FANCA pig model for further therapy research.