Modifikation der microRNA-Expression durch Histonacetylierung im triple-negativen Mammakarzinom

Greiwe, Luisa GND

Das triple-negative Mammakarzinom zeichnet sich durch eine fehlende Expression des Estrogen- und Progesteronrezeptors sowie eine mangelnde Amplifikation des HER2-Wachstumsfaktorrezeptors aus. Diese heterogene Gruppe hat eine schlechte Prognose und die Therapieoptionen sind eingeschränkt. Es ist deswegen dringend erforderlich für das triple-negative Mammakarzinom neue Möglichkeiten der Therapie zu erschließen. Histondeacetylasen (HDACs) sind in vielen Tumorentitäten überexprimiert. Die daraus resultierende verminderte Histonacetylierung reduziert die Transkription verschiedener Bereiche des Genoms. Neben der veränderten Genexpression kann dadurch auch die Expression von microRNAs (miRNAs) verringert sein. Diese kurzen, nicht-kodierenden RNAs regulieren post-transkriptional die Genexpression. So können unter anderem Proliferation, Apoptose und Differenzierung gestört sein. Im Mammakarzinom sind die HDACs ebenfalls häufig überexprimiert und die Acetylierung vermindert. Auch in den verwendeten triple-negativen Brustkrebszelllinien trifft dies zu; die HDAC-Expression war erhöht und die Acetylierung im Vergleich zur Nichttumorzelllinie vermindert. Der verringerten Acetylierung kann durch Hemmung von HDACs entgegengewirkt werden. Dafür wurde in dieser Arbeit der HDAC-Inhibitor Trichostatin A (TSA) eingesetzt. Es konnte der wachstumshemmende Einfluss von TSA auf triple-negative Brustkrebszelllinien gezeigt werden. Weiterhin konnte ermittelt werden, dass die Erhöhung der Acteylierung eine Induktion von miR-192 und miR-194 zur Folge hat. Die Transkription dieser beiden miRNAs wird gemeinsam mit der langen, nicht-kodierenden RNA miR194-2HG reguliert und die Induktion war auf eine verstärkte Acetylierung im Promoterbereich des Wirtsgens zurückzuführen. MiR-192 und miR-194 wirkten in allen drei triple-negativen Brustkrebszelllinien tumorsuppressiv, sie erhöhten die Apoptoserate und hemmten die Zellviabilität. MiR-192 reduzierte die Migrationsfähigkeit der Zellen signifikant. Um die Wirkung der miRNAs auf die Zellen besser verstehen zu können, wurden Gene ermittelt, deren Expression durch die miRNAs beeinflusst wird. Als putatives Zielgen von miR-192 wurde ARHGAP19 untersucht. Der Knockdown dieses Gens zeigte, dass ARHGAP19 nicht an der wachstumshemmenden Wirkung von miR-192 beteiligt war. Die Minderung der Migration wurde aber unter anderem durch die verminderte Expression von ARHGAP19 bedingt. Als putatives Zielgen von miR-194 wurde MSI2 untersucht. Die MSI2-Expression wurde zwar in einigen Zellen durch miR-194 reprimiert, jedoch stellte sich durch die AGO2-Immunpräzipitation heraus, dass eine indirekte Regulation des Gens durch die miRNA vorlag. Durch Versuche nach Knockdown dieses Gens zeigte sich, dass ein Teil der wachstumshemmenden Wirkung von miR-194 auf die Regulation von MSI2 zurückzuführen war. Der Einsatz von HDAC-Inhibitoren bietet eine Alternative oder Ergänzung zur Chemotherapie und auch miRNAs sind eine gute Möglichkeit zum zielgerichteten Einsatz in der Tumorbehandlung. Bei miR-192 und miR-194 handelt es sich um tumorsuppressiv wirkende miRNAs im triple-negativen Mammakarzinom. Ein Einsatz der beiden miRNAs ist in der miRNA-Ersatztherapie denkbar.

Triple negative breast cancer is defined by the lack of expression of estrogen receptor, progesterone receptor and missing amplification of HER2, an epidermal growth factor receptor. This heterogenic group has a poor prognosis and therapy options are limited. Hence it is absolutely necessary to discover new treatment options for triple negative breast cancers. Histone deacetylases (HDACs) are overexpressed in many tumour entities. Consequential hypoacetylation leads to reduced transcription in different areas of the genome. In addition to altered gene expression, microRNA (miRNA) expression may also be affected. These short, non-coding RNAs regulate gene expression post transcriptionally, which in turn may result in perturbated proliferation, apoptosis and differentiation. HDACs are commonly overexpressed in breast cancer as well and acetylation was reduced. In the applied cell lines, HDAC expression was upregulated and aceylation is lowered when compared to a normal breast cell line. Reduced acetylation is opposed by inhibition of HDACs and therefore HDAC-inhibitor Trichostatin A (TSA) was utilised in this study. We demonstrated that TSA inhibits growth in triple negative breast cancer cell lines. Furthermore, it was ascertained that miR-192 and miR-194 were induced by increased acetylation. Transcription of these miRNAs was coregulated together with the long non-coding RNA miR194-2HG and the induction is due to enhanced promoter acetylation of the host gene. MiR-192 and miR-194 had tumour suppressive effects on all the breast cancer cell lines: they promoted apoptosis, reduced proliferation and facilitated cell migration. To understand the impact of the miRNAs on the cells, genes were identified of which expression is influenced by miRNAs. ARHGAP19 was analysed as a putative target of miR-192. Gene knockdown studies indicated that ARHGAP19 wasn’t involved in the growth inhibiting properties of miR-192; however amongst other genes regulated by miR-192, decreased migration was due to reduced ARHGAP19 expression. MSI2 was examined as a putative target of miR-194. MSI2 expression is lowered by miR-194 in some cells, but AGO2 immunoprecipitation proved that this was a result of indirect gene regulation. Knockdown of the gene demonstrated that miR-194 induced indirect regulation of MSI2 contributed to the inhibition of proliferation. The application of HDAC inhibitors provides an alternative or supplement to chemotherapy and miRNAs are a options for targeted tumour therapy. MiR-192 and miR-194 are tumour suppressive miRNAs in breast cancer and their application in miRNA replacement therapy should be further considered.

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Greiwe, Luisa: Modifikation der microRNA-Expression durch Histonacetylierung im triple-negativen Mammakarzinom. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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