Morphologische Charakterisierung der Impfgranulome nach subkutaner Injektion von Ziegen mit BCG und genetisch modifizierten BCG-Derivaten

Die humane Tuberkulose stellt vor allem in Entwicklungs- und Schwellenländern eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten dar. Da der bisher einzige zugelassene Impfstoff, der auf Mycobacterium bovis basierende Bacillus-Calmette-Guèrin (BCG), nicht gegen alle Verlaufsformen der Tuberkulose schützt und zunehmend multiresistente Erreger auftreten, ist es wichtig verbesserte neue Impfstoffe, wie zum Beispiel BCG basierende genetisch modifizierte Impfstoffe, zu entwickeln. In der vorliegenden Studie wurden BCG-Derivate, bei denen das Listeriolysin eingefügt und verschiedene Gene deletiert, waren, einbezogen. Die Hypothese ist, dass hierdurch eine bessere Präsentation der bakteriellen Antigene und eine stärkere Aktivierung von CD8+ T-Lymphozyten erfolgt. Diese Impfstoffkandidaten waren bei Labornagern sicher und verringerten die Erregerbürde bei Belastungsinfektionen. Im nächsten Schritt sollte ihre Wirkung an Ziegen untersucht werden, die dem Menschen vergleichbare Tuberkuloseverläufe und Organveränderungen zeigen. In einem ersten Versuch wurden Ziegen mit VPM1002 (rBCG∆ureC::Hly+), zwei weitere Modifikationen, VPM1002∆pdx-1 und VPM1002∆nuoG, sowie BCG als Vergleichsimpfstoff geimpft und die lokale und systemische Impfreaktion untersucht, um Aussagen zur Sicherheit und Immunogenität zu erhalten. In der vorliegenden Studie wurden die lokalen Gewebeveränderung an der Injektionsstelle sowie Dissemination und Persistenz der Impferreger makroskopisch, histologisch und mikrobiologisch untersucht. Bei den mit BCG und BCG-Derivaten geimpften Ziegen waren nach 4 Monaten Impfgranulome mit zentraler Nekrose, die histologisch als Typ-3 Granulome klassifiziert wurden, zu finden, bis auf zwei mit VPM1002∆pdx-1 geimpfte Tiere, die ein Granulom mit minimaler Nekrose, bzw. eine bindegewebige Narbe aufwiesen. Größe der Impfgranulome und Konsistenz der Nekrose unterschieden sich zwischen den Impfstoffen. Die histologische Untersuchung formalin-fixierter HE-gefärbter Paraffinschnitte zeigte Unterschiede in der Ausdehnung und Organisation des Entzündungszellinfiltrats. Diese ließen sich jedoch nicht bestimmten Impfstoffen zuordnen. In den Nekrosen der Impfgranulome und seltener in Zellen des Entzündungszellinfiltrats ließen sich bei der Mehrzahl der Tiere bei allen Impfstoffen säurefeste Stäbchen nachweisen. Die Kultivierung gelang nur in einzelnen Fällen und bei keinem mit VPM1002∆pdx-1 geimpften Tier. Nach Impfung mit BCG, VPM1002 und VPM1002∆pdx-1 waren bei jeweils 2 von 6 Ziegen Granulome in den drainierenden Lymphknoten zu finden. Es gab keine morphologischen Hinweise auf eine Streuung in weitere Organe und nur bei einem mit BCG geimpften Tier konnte der Impferreger aus dem Mediastinallymphknoten kultiviert werden. Um Unterschiede in der Wirtsreaktion auf die unterschiedlichen BCG-Derivate zu finden, wurde die Zusammensetzung des Entzündungszellinfitrats in den Impfgranulomen immunhistologisch untersucht. Hierfür wurden in konsekutiven Gefrierschnitten Epitheloidzellen, mehrkernige Riesenzellen und Makrophagen, CD4+, CD8+, und γδ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Plasmazellen sowie dendritische Zellen markiert, und Anzahl und Verteilung bei den verschiedenen Impfgruppen verglichen. Im Vergleich zu BCG wurden bei den Derivatimpfstoffen weniger CD4+T-Lymphozyten und weniger B-Lymphozyten, aber signifikant mehr CD8+T-Lymphozyten gefunden. Dies spricht für eine vermehrte Antigenpräsentation über den MHC I-Weg. Auch die Anzahl der mehrkernigen Riesenzellen war bei den Derivatimpfstoffen signifikant geringer. Dies könnte auf eine schnelle Freisetzung des Impferregers aus den Phagolysosomen durch Listeriolysin zurückzuführen sein. Zwischen den Derivatimpfstoffen waren Unterschiede in der Morphologie der Epitheloidzellen zu erkennen, die auf Unterschiede der Interaktion der Impferreger mit diesen Zellen hinweisen. Diese Befunde zeigen, dass Immunsystem der Ziege unterschiedlich auf die verschiedenen Derivatimpfstoffe reagiert. Sie sprechen dafür, dass die Wirkung, die durch die Genmodifikationen erreicht werden sollten, tatsächlich auftritt. Durch ihre hochspezifischen Reaktionen auf Mykobakterien sind Ziegen geeignete Modelltiere, um Hinweise auf den Wirkmechanismus neuer TB-Impfstoffe zu erhalten. Bei zeitgleicher Applikation verschiedener Impfstoffe bei einem Tier könnte die Vergleichbarkeit weiter verbessert und die für Versuche eingesetzte Anzahl an Tieren verringert werden. Die Ergebnisse diese Untersuchung erlauben jedoch keine Aussage zur Protektivität; hierfür sind Belastungsinfektion nach der Impfung in Planung.