Morphologische Charakterisierung der Impfgranulome nach subkutaner Injektion von Ziegen mit BCG und genetisch modifizierten BCG-Derivaten

Heyl, Johannes GND

Die humane Tuberkulose stellt vor allem in Entwicklungs- und Schwellenländern eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten dar. Da der bisher einzige zugelassene Impfstoff, der auf Mycobacterium bovis basierende Bacillus-Calmette-Guèrin (BCG), nicht gegen alle Verlaufsformen der Tuberkulose schützt und zunehmend multiresistente Erreger auftreten, ist es wichtig verbesserte neue Impfstoffe, wie zum Beispiel BCG basierende genetisch modifizierte Impfstoffe, zu entwickeln. In der vorliegenden Studie wurden BCG-Derivate, bei denen das Listeriolysin eingefügt und verschiedene Gene deletiert, waren, einbezogen. Die Hypothese ist, dass hierdurch eine bessere Präsentation der bakteriellen Antigene und eine stärkere Aktivierung von CD8+ T-Lymphozyten erfolgt. Diese Impfstoffkandidaten waren bei Labornagern sicher und verringerten die Erregerbürde bei Belastungsinfektionen. Im nächsten Schritt sollte ihre Wirkung an Ziegen untersucht werden, die dem Menschen vergleichbare Tuberkuloseverläufe und Organveränderungen zeigen. In einem ersten Versuch wurden Ziegen mit VPM1002 (rBCG∆ureC::Hly+), zwei weitere Modifikationen, VPM1002∆pdx-1 und VPM1002∆nuoG, sowie BCG als Vergleichsimpfstoff geimpft und die lokale und systemische Impfreaktion untersucht, um Aussagen zur Sicherheit und Immunogenität zu erhalten. In der vorliegenden Studie wurden die lokalen Gewebeveränderung an der Injektionsstelle sowie Dissemination und Persistenz der Impferreger makroskopisch, histologisch und mikrobiologisch untersucht. Bei den mit BCG und BCG-Derivaten geimpften Ziegen waren nach 4 Monaten Impfgranulome mit zentraler Nekrose, die histologisch als Typ-3 Granulome klassifiziert wurden, zu finden, bis auf zwei mit VPM1002∆pdx-1 geimpfte Tiere, die ein Granulom mit minimaler Nekrose, bzw. eine bindegewebige Narbe aufwiesen. Größe der Impfgranulome und Konsistenz der Nekrose unterschieden sich zwischen den Impfstoffen. Die histologische Untersuchung formalin-fixierter HE-gefärbter Paraffinschnitte zeigte Unterschiede in der Ausdehnung und Organisation des Entzündungszellinfiltrats. Diese ließen sich jedoch nicht bestimmten Impfstoffen zuordnen. In den Nekrosen der Impfgranulome und seltener in Zellen des Entzündungszellinfiltrats ließen sich bei der Mehrzahl der Tiere bei allen Impfstoffen säurefeste Stäbchen nachweisen. Die Kultivierung gelang nur in einzelnen Fällen und bei keinem mit VPM1002∆pdx-1 geimpften Tier. Nach Impfung mit BCG, VPM1002 und VPM1002∆pdx-1 waren bei jeweils 2 von 6 Ziegen Granulome in den drainierenden Lymphknoten zu finden. Es gab keine morphologischen Hinweise auf eine Streuung in weitere Organe und nur bei einem mit BCG geimpften Tier konnte der Impferreger aus dem Mediastinallymphknoten kultiviert werden. Um Unterschiede in der Wirtsreaktion auf die unterschiedlichen BCG-Derivate zu finden, wurde die Zusammensetzung des Entzündungszellinfitrats in den Impfgranulomen immunhistologisch untersucht. Hierfür wurden in konsekutiven Gefrierschnitten Epitheloidzellen, mehrkernige Riesenzellen und Makrophagen, CD4+, CD8+, und γδ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Plasmazellen sowie dendritische Zellen markiert, und Anzahl und Verteilung bei den verschiedenen Impfgruppen verglichen. Im Vergleich zu BCG wurden bei den Derivatimpfstoffen weniger CD4+T-Lymphozyten und weniger B-Lymphozyten, aber signifikant mehr CD8+T-Lymphozyten gefunden. Dies spricht für eine vermehrte Antigenpräsentation über den MHC I-Weg. Auch die Anzahl der mehrkernigen Riesenzellen war bei den Derivatimpfstoffen signifikant geringer. Dies könnte auf eine schnelle Freisetzung des Impferregers aus den Phagolysosomen durch Listeriolysin zurückzuführen sein. Zwischen den Derivatimpfstoffen waren Unterschiede in der Morphologie der Epitheloidzellen zu erkennen, die auf Unterschiede der Interaktion der Impferreger mit diesen Zellen hinweisen. Diese Befunde zeigen, dass Immunsystem der Ziege unterschiedlich auf die verschiedenen Derivatimpfstoffe reagiert. Sie sprechen dafür, dass die Wirkung, die durch die Genmodifikationen erreicht werden sollten, tatsächlich auftritt. Durch ihre hochspezifischen Reaktionen auf Mykobakterien sind Ziegen geeignete Modelltiere, um Hinweise auf den Wirkmechanismus neuer TB-Impfstoffe zu erhalten. Bei zeitgleicher Applikation verschiedener Impfstoffe bei einem Tier könnte die Vergleichbarkeit weiter verbessert und die für Versuche eingesetzte Anzahl an Tieren verringert werden. Die Ergebnisse diese Untersuchung erlauben jedoch keine Aussage zur Protektivität; hierfür sind Belastungsinfektion nach der Impfung in Planung.

Human tuberculosis continous to be one of the most important infectious diseases especially in threshold and developing countries. Because the only licenced vaccine, Bacillus-Calmette-Guèrin (BCG), which is derived from Mycobacterium bovis is not protective against all clinical courses of tuberculosis and the number of multiresistant mycobacterial strains increases, it is essential to develop improved vaccines, e.g. genetically modified BCG vaccines. BCG derivates which had listeriolysin added and several genes deleted were included in the present study. The hypothesis was that these genetic modifications induce better presentation of the bacterial antigens and stronger activation of CD8+T-lymphocytes. The vaccines candidates were safe in laboratory rodents and decreased the bacterial burden in challenge infections. As next step, it was planned to test them in goats, that develop clinical disease and tissue lesions comparable to humans. In a first experimental trial, goats were vaccinated with VPM1002 (rBCG∆ureC::Hly+), two vaccines with additional genetic modifications, VPM1002∆pdx-1 and VPM1002∆nuoG, as well as BCG for comparison. Local and systemic reactions to the vaccines were examined to determine safety and immunogenicity. In the investigation presented, local tissue lesions at the injection site as well as dissimination and persistence of the injected microorganisms were examined by macroscopic inspection and by histological and microbiological methods. Vaccine-induced granulomas with central necrosis that were classified as type 3 granulomas were found in all goats vaccinated with BCG and BCG derivates 4 month after vaccination with the exception of two goats that had received VPM1002∆pdx-1. One of those goats had a granuloma with minimal necrosis (type 2 granuloma) and the other a connective tissue scar. Size of vaccination induced granulomas and consistency of the central necrosis varied between the vaccines. Histological examination of formalin-fixed and HE-stained paraffin sections revealed differences in extent and organisation of the inflammatory infiltrate. These could, however, not be assigned to certain vaccines. Acid fast bacteria were regularly detected in the central necrosis and rarely in cells of the inflammatory infiltrate in the majority of animals irrespective of the vaccine. Cultivation was successful only in a few cases and in none of the goats that had received VPM1002∆pdx-1. Granulomas were found in draining lymph nodes of two goats each that had been vaccinated with BCG, VPM1002 and VPM1002∆pdx-1. There were no morphological signs for dissimination to other organs. Cultural isolation was only possible from the mediastinal lymph node of one goat that had received BCG. To detect potential differences in the host reaction to the BCG derivates, composition of the inflammatory infiltrates in the vaccine-induced granulomas was examined by immunohistology. For this, epitheloid cells, multinucleated giant cells, macrophages, CD4+-, CD8+- and γδ T lymphocytes, B lymphocytes and plasma cells as well as dendritic cells were labelled in consecutive frozen sections, and number and distribution compared between the different vaccine groups. In the granulomas induced by the derivate vaccines, less CD4+ T lymphocytes and less B lymphocytes, but significantly more CD8+ T lymphocytes were present compared to the BCG-induced granulomas. This suggests increased antigen presentation via MHC I. The number of multinucleated giant cells was also significantly lower after application of the derivate vaccines. This might be attributed to the accelerated release of mycobacteria from phagolysosomes by listeriolysin. There were also morphological differences between epitheloid cells which indicate differences in the interaction of the genetically modified mycobacteria with these cells. These findings demonstrate that the immune system of goats reacts distinctly to the different BCG derivate vaccines. They indicate that the effects intended by the genetic modifications actually occur. By their highly specific reactions, goats are a highly useful model species to obtain information about the mode of action of new tuberculosis vaccines. The application of different vaccines to one animal might further improve comparability and reduce the number of experimental animals. The results of this investigation do not allow conclusions about protection; for this challenge infections are in the planning stage.

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Heyl, Johannes: Morphologische Charakterisierung der Impfgranulome nach subkutaner Injektion von Ziegen mit BCG und genetisch modifizierten BCG-Derivaten. Hannover 2018. Tierärztliche Hochschule Hannover.

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