Quantitative detection of Potato virus Y and Potato leaf roll virus by real time PCR – a molecular approach with numerous applications in potato research
Virus resistance research on potato has a high priority. In African potato growing countries the majority of seed tubers offered on rural markets are infected with potato viruses, such as Potato virus Y (PVY) and/or Potato leaf roll virus (PLRV) resulting in a catastrophic reduction of yields. By contrast, in industrial nations virus infection of potatoes is virtually irrelevant due to efficient seed certification schemes. Nevertheless, the high yield loss potential has led PVY and PLRV becoming two of the most important pathogens on the potato crop worldwide. Due to their high replication rate viruses evolve quickly and could overcome existing resistances. In the recent history, common PVY strains, were more and more replaced by recombinant strains, such as PVYN-Wi , PVYN:O or PVYNTN that are highly virulent and able to cause the potato tuber necrotic ring spot disease (PTNRD). Taken together, these challenges in potato research and production call for an increased knowledge about the epidemiology of PVY and PLRV strains. Furthermore, breeding programs have to focus on the introduction of new resistance genes and generation of varieties that are adapted to the climatic conditions of their growing regions. These efforts can be supported by reliable and sensitive virus detection methods. In this thesis the development and applications of reverse transcription real-time PCR (RTqPCR) detection assays are presented that are able to quantify the worldwide most important potato viruses PVY and PLRV and thus can contribute to several areas of potato research. It is demonstrated that the developed RT-qPCR assay for the quantification of PVY is highly sensitive and can be utilized for the direct testing even of freshly harvested tubers during seed certification. A similar sensitive assay was applied to evaluate Solanum species and progenies of somatic hybrids regarding their level of resistance to PVY. The accumulation of PVY differed in progenies of wild potato species that previously were uniformly classified as extreme resistant. Therefore, RT-qPCR may be an interesting tool for a resistance evaluation in breeding programs. Another application of RT-qPCR is the estimation of virulence of different PLRV isolates. A correlation between the PLRV titer in potato plants and virulence could not be assessed. However, a discriminating quantification of different PLRV RNA species allows further epidemiological studies. Finally, RT-qPCR was demonstrated to be a useful tool to evaluate the equivalence of genetically modified potatoes regarding their level of susceptibility to PVY. An increased susceptibility to PVY could be a reliable indicator for possible unintended effects caused by the genetic modification. It is shown that equivalence is difficult to approve if the non-transgenic comparator is non-equivalent and if the classification into equivalent or non-equivalent is dependent on environmental conditions.
Virusresistenzforschung an der Kartoffel hat hohe Priorität. In Kartoffelanbauregionen Afrikas ist die Mehrzahl der auf regionalen Märkten angebotenen Knollen mit Kartoffelviren, wie Potato virus Y (PVY) und/oder Potato leaf roll virus (PLRV) infiziert, was regelmäßig zu katastrophalen Ernteausfällen führt. Im Gegensatz dazu spielen Viruskrankheiten der Kartoffel aufgrund effizienter Saatgutzertifizierungssysteme in Industrienationen kaum eine Rolle. Nichtsdestotrotz zählen PVY und PLRV aufgrund des hohen potentiellen Ertragsverlustes weltweit zu den bedeutendsten Pathogenen der Kartoffel. Wegen ihrer hohen Replikationsrate entwickeln sich Viren sehr schnell und könnten bestehende Resistenzen überwinden. In jüngster Zeit wurden die gewöhnlichen PVY-Stämme immer mehr durch rekombinante Stämme, wie PVYN-Wi oder PVYN:O und PVYNTN verdrängt. Diese sind höchst virulent und sind Verursacher von Ringnekrosen an Kartoffelknollen (potato tuber necrotic ringspot disease: PTNRD). Diese Herausforderungen in der Kartoffelforschung und im Kartoffelanbau erfordern erweiterte Kenntnisse über die Epidemiologie von PVY- und PLRV-Stämmen. Zudem müssen sich Züchtungsprogramme der Kartoffel auf die Einführung neuer Resistenzgene und der Generierung von Genotypen konzentrieren, die an die klimatischen Bedingungen ihrer Anbauregion angepasst sind. Zuverlässige und sensitive Methoden zur Virusdetektion können bei der Lösung der genannten Herausforderungen helfen. In dieser Arbeit werden die Entwicklung und Anwendung von reverse transcription real-time PCR (RT-qPCR)-Detektionsverfahren vorgestellt, die die weltweit bedeutendsten Kartoffelviren PVY und PLRV quantifizieren und damit einen wichtigen Beitrag auf verschiedenen Gebieten der Kartoffelforschung leisten können. Es wird dargestellt, dass das entwickelte RT-qPCR-Detektionsverfahren für die Quantifizierung von PVY hoch sensitiv ist und für die direkte Testung sogar frisch-geernteter Kartoffelknollen während der Saatgutzertifizierung eingesetzt werden kann. Ein ähnlich sensitives Verfahren wurde verwendet, um Solanum-Arten und Nachkommen von somatischen Hybriden auf das Niveau ihrer Resistenz gegen PVY zu bewerten. Die Anreicherung von PVY variierte zwischen den Wildkartoffelarten, die bis dahin einheitlich als extrem resistent eingestuft worden waren. Somit könnte die RT-qPCR ein interessantes Werkzeug für die Resistenz-Evaluierung in Züchtungsprogrammen sein. Eine andere Anwendung der RT-qPCR stellt die Einschätzung der Virulenz verschiedener PLRV-Isolate dar. Ein Zusammenhang zwischen dem PLRV-Titer in Kartoffelpflanzen und der Virulenz der Virusisolate konnte nicht ermittelt werden. Allerdings erlaubt die unterscheidende Quantifizierung verschiedener PLRV RNA-Arten weitere epidemiologische Studien. Abschließend wurde demonstriert, dass die RT-qPCR ein nützliches Werkzeug ist, um die Äquivalenz gentechnisch veränderter Kartoffeln hinsichtlich ihrer PVY-Anfälligkeit zu untersuchen. Eine erhöhte Anfälligkeit für PVY könnte ein verlässlicher Indikator für mögliche ungewollte Effekte sein, die durch die genetische Modifikation verursacht wurden. Es wird gezeigt, dass der Nachweis von Äquivalenz schwierig ist, wenn der nicht-transgene Komparator selbst nicht äquivalent ist und wenn die Einstufung in äquivalent und nicht-äquivalent abhängig von Umweltbedingungen ist.
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