Novel Serological Assays for Determination of the Distribution and of Hosts of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus

Das Krim-Kongo-Hämorrhagische-Fieber-Virus (CCHFV) ist ein Zecken-übertragenes Virus, das in vielen Ländern Afrikas, Asiens und Europas endemisch ist. Seine Vektoren und Reservoire sind Schildzecken, die das Virus während der Blutmahlzeit auf ihre Blutwirte übertragen und umgekehrt. CCHFV löst in Tieren keine Erkrankung aus, diese können aber eine Virämie entwickeln und serokonvertieren. Durch Zeckenstiche, das Zerdrücken infizierter Zecken oder durch den Kontakt zu Blut, Körperflüssigkeiten oder Geweben virämischer Tiere und Menschen kann das Virus auf Menschen übertragen werden und in ihnen eine schwere Erkrankung, das Krim-Kongo-Hämorrhagische-Fieber (Crimean-Congo hemorrhagic Fever, CCHF) auslösen, das mit einer Sterblichkeitsrate von bis zu 80% einhergeht. Bisher ist weder eine Impfung noch eine spezifische Therapie verfügbar. In den letzten fünfzehn Jahren sind CCHF Fälle in vier bis dato als CCHF-frei geltenden europäischen Ländern erstmals aufgetreten, unter ihnen Spanien als erstes betroffenes westeuropäisches Land 2016. Trotz der Angst einer weiteren Ausbreitung in Europa und trotz der Dringlichkeit der Vorbeugung humaner Infektionen ist wenig über die Verbreitung von CCHFV außerhalb der Länder, aus denen bereits CCHF-Fälle berichtet wurden, bekannt. Hierzu können Seroprävalenzstudien in Tieren wesentliche Hinweise liefern, jedoch sind keine kommerziellen serologischen Tests zur Diagnostik von CCHFV in Tieren verfügbar und die bisher publizierten laborspezifischen Tests wurden nicht validiert. Deshalb war das Ziel der hier vorgelegten Arbeit, Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA) Tests zur Detektion CCHFV-spezifischer IgG Antikörper in Tieren zu entwickeln und zu validieren. Zunächst wurden Spezies-spezifische Tests zur Detektion CCHFV-spezifischer Antikörper in Schafen und Ziegen auf Basis eines Protokolls zur Untersuchung von Rindern durch Modifikation verschiedener Parameter hergestellt. Dabei ist der neue CCHFV in-house-ELISA zur Untersuchung von Ziegenseren der erste speziell für diese Spezies hergestellte CCHFV-ELISA. Als Referenztestes wurden kommerziell erhältliche, für die Untersuchung humaner Seren hergestellte ELISAs und Immunfluoreszenztests für die Untersuchung von Schafen und Ziegen adaptiert. Alle Tests wurden durch vergleichende Analyse gegeneinander validiert, wobei diagnostische Sensitivitäten und Spezifitäten von 94 bis 100% ermittelt werden konnten. Außerdem wurden diese sowie Rinder-spezifische Tests in zwei Seroprävalenzstudien in Albanien und der Ehemaligen Jugoslawischen Republik Mazedonien beziehungsweise Bulgarien und der Türkei durchgeführt, wobei eine hohe Seroprävalenz in den aus diesen Ländern untersuchten Rindern, Schafen und Ziegen gefunden wurde. Die Ergebnisse weisen auf eine starke Zirkulation des Virus in der Ehemaligen Jugoslawischen Republik Mazedonien hin, was überraschend ist, da von dort bisher nur wenige CCHF-Fälle berichtet wurden. Außerdem belegen sie eine Verbreitung des Virus über ganz Albanien und verifizieren den Süden Bulgariens und die Nord- und Zentraltürkei als Hauptendemiegebiete in diesen beiden Ländern. Um zu ermitteln, welche Tierart der geeignetste Indikator für die Verbreitung von CCHFV ist, wurde die Seroprävalenz der drei getesteten Tierarten aus Albanien und der Ehemaligen Jugoslawischen Republik Mazedonien miteinander verglichen. Hierbei wurde ermittelt, dass Schafe und Ziegen geeignetere Indikatoren sind als Rinder und deshalb bevorzugt zur Ermittlung der Verbreitung von CCHFV herangezogen werden sollten. Neben den Spezies-spezifischen Tests wurde der erste auf rekombinantem Antigen basierende kompetitive ELISA (cELISA) für CCHFV und der zweite überhaupt beschriebene CCHFV cELISA entwickelt und unter Verwendung von 833 Seren von zwölf verschiedenen Tierarten und Menschen validiert, wobei eine diagnostische Sensitivität von 95% und eine diagnostische Spezifität von 99% ermittelt wurden. Zuvor waren 33 CCHFV-spezifische monoklonale Antikörper (mAk) in verschiedenen Tests charakterisiert worden, um den für die Entwicklung des Tests geeignetsten mAk zu identifizieren. Mittels des neuen cELISA können Seroprävalenzstudien in verschiedenen Tierarten durchgeführt werden, auch um die Rolle verschiedener Tierarten im Infektionsgeschehen des Virus zu verstehen. Außerdem können mittels des Tests Tierarten, die essentiell zur Aufrechterhaltung der Viruszirkulation in der Natur sind, identifiziert und dann gegen CCHFV und/oder Zeckenbefall geimpft werden. Der monoklonale Antikörper, der im cELISA verwendet wird, sowie sein Epitop, könnten darüber hinaus vielversprechend für die Entwicklung diagnostischer Tests, Therapeutika und Impfungen sein. Die neuen Tests zur Detektion CCHFV-spezifischer Antikörper haben sich als verlässlich und einfach durchführbar erwiesen und sollten kommerzialisiert und CCHF-betroffenen und gefährdeten Ländern zur Identifikation von Risikogebieten und Erstellung von CCHFV-Verbreitungskarten zur Verfügung gestellt werden.