Seroprevalence of Rift Valley fever virus specific antibodies in livestock in Egypt and expression studies of virus related proteins in mammalian and arthropod cells

Rift Valley Fieber Virus, ein Phlebovirus innerhalb der Familie Phenuiviridae verursacht schwere Ausbrüche sowie große Epidemien in vielen afrikanischen Ländern bei denen insbesondere Menschen, Wiederkäuer und Kamele betroffen sind. Das Virus wurde im Jahr 1977 nach Ägypten eingeschleppt, wo es eine massive Epidemie mit tausenden infizierten Menschen, vielen Verlusten innerhalb der Nutztierpopulation und großen ökonomischen Einbußen verursachte. Bis jetzt gilt diese Epidemie als eine der größten in der afrikanischen Geschichte. Nach einer langen inter-epidemischen Phase trat das Rift Valley Fieber erneut 1993 im ägyptischen Nildelta auf; weitere Ausbrüche folgten 1994, 1997 und zuletzt 2003. Die Ursachen der verschiedenen Ausbrüche, sowie das langfristige Überdauern des Virus während der inter-epidemischen Phasen, in denen das Virus auf niedrigem Level zwischen Mücken und Wildwiederkäuern zirkuliert, sind nicht gänzlich bekannt. Seroepidemiologische Studien sind nützlich, um den aktuellen Antikörperstatus von nicht-immunisierten Tieren in verschiedenen Regionen zu beobachten. Außerdem können diese Untersuchungen zu einer epidemiologischen Risikoanalyse beitragen, um die aktuelle Gefahr erneuter Rift Valley Fieber Ausbrüche zu evaluieren. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, 873 Feldseren von nicht immunisierten Tieren, bestehend aus Schafen, Ziegen, Büffeln und Kamelen aus verschiedenen ägyptischen Gouvernements auf das Vorhandensein von anti-RVFV Antikörpern serologisch mittels kommerziellen ELISA, Virusneutralisationstest und indirekter Immunfluoreszenz zu untersuchen. Diese Untersuchung zeigte in erster Linie ein niedriges Antikörpervorkommen von 2,3 Prozent in den untersuchten Tieren, ohne jegliche Anzeichen akuter Infektionen. Die höchste Prävalenz von 9,9 Prozent wurde bei Kamelen aus einem Schlachthof in der Nähe von Kairo detektiert. Darüber hinaus wurde in einer weiteren Studie von 1.349 Seren nicht-immunisierter Rinder eine Seroprävalenz von 7,9 Prozent festgestellt. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf eine geringe Virusverbreitung innerhalb der aktuellen interepidemischen Phase hin, folglich aber auch auf das Vorhandensein des Virus im ägyptischen Nildelta. Zusätzlich unterstreichen diese Resultate die bedeutende Rolle von Boviden und Kameliden im RVFV-Vermehrungszyklus in Ägypten. Vermutlich ist die Viruspersistenz und das potenzielle aktive Auftreten des RVFV im Land erst durch das Vorhandensein nicht geimpfter, empfänglicher Tiere in Kombination mit günstigen Bedingungen für die Mückenvermehrung möglich. Aus diesem Grund wurde in Ägypten ein für Afrika und weltweit einzigartiges Impfprogramm etabliert. Demnach sollen alle empfänglichen Tiere zweimal im Jahr mit einem lokal produzierten, inaktiven anti-RVFV-Impfstoff geimpft werden. Auch wenn dieses Programm bereits 1980 eingeführt wurde, sind nur wenige Informationen bezüglich der Effektivität der Impfung und der verbundenen Serokonversion der immunisierten Nutztiere verfügbar. Vor diesem Hintergrund führten wir eine vergleichende Studie von immunisierten und nicht-immunisierten Milchkühen aus vier Gouvernements im Nildelta durch. Es wurden 2.818 Rinderseren aus 26 verschiedenen Farmen, die an dem offiziellen Impfprogramm teilnehmen im Vergleich zu 1.349 Rinderseren aus 27 Kleinsthaltungen ohne Impfprogramm gegen RVFV analysiert. Die serologischen Testungen wurden in einem drei-stufigen Ansatz durchgeführt. Nach Untersuchung mit einem kommerziellen ELISA folgten Bestätigungstests bei positiven und fraglichen Resultaten mittels Virusneutralisations- und Immunfluoreszenztest. Überraschenderweise zeigten die Ergebnisse bei den immunisierten Rindern mit nur 15 Prozent eine geringe Seroprävalenz, die nicht signifikant höher war als die Prävalenz der nicht geimpften Tiere (7,9%). Darüber hinaus konnten wir große Unterschiede in der Seroprävalenz zwischen den einzelnen Farmen feststellen. Derartige inadäquate Impflevel in Verbindung mit fehlenden DIVA-Vakzinen kehren den nutzbringenden Effekt eines Impfprogramms um und erwecken ernste Bedenken bezüglich des ägyptischen Gesundheitsmanagements von Mensch und Tier. Eine erneute Evaluierung des Impfprogramms in Ägypten ist demzufolge dringend anzuraten. Ein Verständnis der RVFV-Ausbruchsgeschehen setzt neben Kenntnissen über die Virusvermehrung in den empfänglichen Tieren auch eine Kenntnis der Virusvermehrung in den Mückenvektoren voraus. In beiden Fällen sollten die Nicht-Strukturproteine NSs und NSm Beachtung finden, die die Hauptvirulenzfaktoren des Virus darstellen. Das NSs und NSm Protein manipulieren die Immunabwehr von Wirtzellen der Säugetiere mittels einer Beeinträchtigung der Interferon-Antwort beziehungsweise mit der Inhibition der virusinduzierten Apoptose von infizierten Zellen. Die Bedeutung in der Amplifikation und Persistenz in den Mücken ist jedoch weitestgehend unbekannt. Aus diesem Grund war die vergleichende Infektionsstudie mit dem RVF-Impfstamm MP12, in der die Proteinexpression in Säugetier- und Arthropodenzellen verfolgt wurde, ein weiterer Teil dieser Arbeit. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen die beiden Nicht-Strukturproteine generiert und für den Einsatz in der Immunfluoreszenz und im Western Blot validiert. Die Expressionsstudie wurde durch monoklonale Antikörper gegen das Nukleokapsidprotein und die beiden Glykoproteine komplettiert. Dadurch bestand die Möglichkeit, fünf verschiedene virale Proteine während der Infektion von Vero 76 und C6/36 Zellen zu verfolgen. Zytopathische Effekte wurden nur bei den Vero-Zellen beobachtet, ebenso zeigten nur die Säugetierzellen die auf das NSs Protein basierenden filamentösen Strukturen in den Zellkernen. Im Gegensatz dazu befand sich das NSs Protein im gesamten Zytoplasma der Mückenzellen verteilt und formte kleine Punkte nach einer Infektionszeit von 72 Stunden. Des Weiteren wird durch die vermehrte Expression des NSm Proteins in den C6/36 Zellen im Vergleich zu den Vero-Zellen die Relevanz dieses Proteins in den Mückenzellen hervorgehoben. Diese Ergebnisse geben weitere Hinweise für die unterschiedliche Rolle von NSs während der Replikation in Säugetier- im Vergleich zur Mückenzelle und verdeutlichen die unterschiedlichen anti-viralen Bekämpfungsstrategien. Insgesamt unterstützen die vorliegenden Ergebnisse aus den serologischen Analysen der ägyptischen Nutztiere die These einer momentan geringen Viruszirkulation im Nildelta. Die defizitäre Serokonversion geimpfter Rinder unterstreicht jedoch die Notwendigkeit einer erneuten Evaluation des Impfprogrammes in Ägypten. Die in dieser Arbeit beschriebene Expressionskinetik der RVFV assoziierten Proteine ermöglicht außerdem zum ersten Mal den Vergleich der fünf Proteine des RVFV und gibt damit weitere Hinweise auf die besonderen Rollen der Nicht-Strukturproteine in Vektor- und Wirtszelle.