Analyse der Infektion boviner Epithelzellen mit Coxiella burnetii im in vitro-Modell

Bonkowski, Katharina GND

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläres Bakterium, welches zu den zoonotischen Pathogenen zählt. Es ist der Auslöser des Q-Fiebers beim Menschen und verfügt über ein weites Wirtsspektrum, wobei Wiederkäuer die Hauptinfektionsquelle darstellen. Der Erreger wird in sehr großen Mengen über Kot, Milch oder auch plazentale Produkte ausgeschieden und anschließend über die Luft verbreitet. Innerhalb des Wirtes repliziert das Bakterium vor allem in Immunzellen aber auch in Epithelzellen in parasitophoren Vakuolen. Der extrem saure pH dieser Zellkompartimente aktiviert den bakteriellen Metabolismus und die Expression von Effektormolekülen zum Überleben innerhalb der Wirtszellen. Jedoch ist das Wissen über die detaillierte Interaktion mit Wirtszellen bis dato noch sehr gering. Viele in vitro-Studien brachten erste Erkenntnisse zum Infektionsprozess. Es konnte auch gezeigt werden, dass Coxiellen in einer Vielzahl von Zellen replizieren. Jedoch sind die meisten verwendeten Zellen nicht spezifisch für die natürlichen Wirtstiere. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bovine Epithelzellen von möglichen Eintritts- (Lungenepithel) und Austrittsorten (Plazenta-, Darm-, Euterepithel) des Wirtes mit dem virulenten Stamm Nine Mile I (NMI, LPS der Phase I) und dem avirulenten Stamm NMII (LPS der Phase II) von C. burnetii infiziert. Das verwendete in vitro-System zeigte, dass die Epithelzellen eine unterschiedliche Permissivität gegenüber Coxiellen aufweisen. Die Coxiellen konnten unabhängig vom Stamm in unterschiedlicher Menge an die Zellen assoziieren und in ihnen replizieren. In der Lungen- und Plazentazellinie konnten kaum Coxiellen nachgewiesen werden. Die Epithelzellen der Milchdrüsen im Euter zeigten eine starke Replikation der Coxiellen. Zudem konnten nur bei Darm- und Euterzellen in mikroskopischen Studien parasitophore Vakuolen nachgewiesen werden. Während der Infektion der Epithelzellen konnte zudem keine Beeinflussung der Wirtszellvitalität und der Expression immunologischer Botenstoffe, d. h. Veränderung der Zytokinexpression, nachgewiesen werden. Da die Euterepithelzelllinie eine sehr gute Basis für die Replikation der Coxiellenstämme darstellte, wurde anhand dieser die Wirt-Erreger-Interaktion auf Proteomebene untersucht. Dazu erfolgte die Analyse von Proteingesamtzelllysaten der Epithelzellen nach 14-tägiger stabiler Infektion mit jeweils einem Coxiellenstamm mittels 2D-DIGE und LC-MS/MS-Analyse. Anhand beider Analysen konnten insgesamt um die 40 regulierte Wirtszellproteine ermittelt werden, die den Einfluss des Pathogens während der Infektion widerspiegeln. Dies entsprach einer Regulierung des detektierten Gesamtwirtsproteoms von 1% bis 5 %. Eine Beeinflussung konnte in der Zytoskelettorganisation, der Genexpression, bei Zellsignalwegen bzw. Zellregulierungsprozessen, der Stressantwort, bei Proteinprozessierungsprozessen und im Zellstoffwechsel bei beiden Coxiellenstämmen abgeleitet werden. Die Studien ergaben eindeutige Hinweise auf eine Regulation der Wirtszellzytokinese. Dabei konnte zum einen beobachtet werden, dass die infizierten Zellen sich nicht so stark vermehren wie uninfizierte Zellen. Zum anderen wurden Proteine nachgewiesen, die die Zellteilung grundlegend beeinflussen können. Die Proteomanalysen untermauern zudem die bereits vorhandenen Annahmen, dass Coxiellen während der Infektion anti-apoptotisch auf die Wirtszellen wirken können. Eine Validierung der gewonnenen Erkenntnisse in Hinblick auf die beeinflussten Zellprozesse konnte jedoch bisher nicht durchgeführt werden. Neben bovinen Proteinen erfolgte auch der Nachweis der Expression von coxiellären Proteinen während der Infektion in Epithelzellen. Die beiden verwendeten Methoden ermöglichten insgesamt die Identifikation von über 500 Coxiellenproteinen, wobei die Mehrzahl derer bei beiden Stämmen identisch war. Es konnten z. B. Proteine detektiert werden, die auf die vermehrte replikative Aktivität der Bakterien und auch auf deren anti-apoptotisches Wirken hinweisen. Auffällig war zudem die Verteilung der pI der Proteine. Die meisten Proteine wiesen einen basischen oder sauren pI auf, welches höchstwahrscheinlich das Überleben in einem stark angesäuerten Kompartiment innerhalb der Wirtszelle unterstützt.

The obligate intracellular bacterial pathogen C. burnetii is the causative agent of Q fever in humans. The most important infection source are ruminants which may shed the bacteria in high numbers via placental products, feces and milk. The agent is spread by aerolsols. After internalization into host cells via phagocytosis C. burnetii replicates especially in monocytes and other immune cells in parasitophoric vacuoles. The extreme acidic pH inside the cell compartment activates the bacterial metabolism and expression of effector molecules for survival. Knowledge about the interaction of Coxiellae with their host is nominal. There are some in vitro studies which analyzed the replication characteristics and give some hints on host-pathogen interactions but most cell lines deployed thus far are not specific for one of the reservoir host, i. e. ruminants. Within this work bovine epithelial cells of the entry (lung) and exit site (placenta, intestine, mammary gland) of the host were infected with virulent and avirulent variants of the Nine Mile (NM) strain of C. burnetii, expressing phase I (NMI) and phase II (NMII) LPS, respectively. This in vitro system showed that different epithelial cells had a distinct permissiveness to Coxiellae independent on the virulence of the strains used. In lung and placental epithelial cells, just a minor number of bacteria was cell-assoziated compared with intestinal and mammary gland (udder) cells. The highest replication rate was detected in the udder epithelial cells with formation of large acidic vacuoles inside the cells. Some smaller parasitophoric vacuoles could also detected in intestinal cells after microscopic analysis. Interestingly, infection and replication occoured without an influence on cell vitality or immunological state (changes of cytokine expression). The udder cells, which showed the highest infection rate, were used for further host-pathogen interaction studies at proteome level. Protein samples of epithelial cells infected with Coxiella strains for 14 days were analyzed via 2D-DIGE and LC-MS/MS analysis. With the help of both proteome studies a total of about 40 differentially regulated host proteins were detected, which reflect the influence of Coxiellae on the host cells during infection. This corresponds to a regulation of one to five percent to the detected whole host proteome. There was an influence in cytoskeleton organization, gene expression, cell signaling/regulation, stress response, protein processing and cell metabolism independent of the strain. These studies provided strong indications that there was regulation during infection especially in cytokinesis and apoptotic processes. The data will provide a valuable basis for targeted functional studies in order to better understand host-pathogen interactions in the reservoir host at cellular level. Coxiella-encoded and expressed proteins could also be detected during the infection process. Both applied proteome methods enabled the identification of over 500 bacterial proteins, with the majority of proteins being identical for both strains. The pI distribution of the proteins was quite noticeable. Most of them had a basic oder acidic pI. This may support the survival of Coxiellae inside the acidic compartment inside the host cells.

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Bonkowski, Katharina: Analyse der Infektion boviner Epithelzellen mit Coxiella burnetii im in vitro-Modell. Jena 2017. Friedrich-Schiller-Universität Jena, Biologisch-Pharmazeutische Fakultät.

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