Factors influencing the fate of Salmonella in the plant and soil environment
Fresh fruits and vegetables are increasingly recognized as part of a healthy diet. However, disease outbreaks caused by Salmonella linked to fresh produce indicate that raw fruits and vegetables could be a vector for human pathogens. Contamination of fresh produce with Salmonella can occur along the whole production chain and one possible source is contaminated soil. Soil, rhizosphere and phyllosphere are heterogenous habitats where conditions can change quickly and survival of human pathogens in this environment is influenced by various biotic and abiotic factors. So far, the ecology of Salmonella in the environment is largely unknown and this thesis aimed at extending the knowledge of factors influencing the persistence of Salmonella in the soil-plant environment. In this thesis, microcosm and greenhouse experiments were conducted to analyze factors influencing the fate of Salmonella under defined conditions. Lettuce (Lactuca sativa cv. Tizian) was used as a model plant and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 as a model human pathogen. S. Typhimurium LT2 was inoculated into soil and its fate was monitored using cultivation-dependent and -independent methods. Among the factors investigated in this thesis, the influence of preadaptation, meaning the conditions which the bacteria encounter before their introduction into the analyzed environment, on the survival of S. Typhimurium LT2 was investigated in soil microcosms. It was found that numbers of cultivable S. Typhimurium LT2 cells were significantly higher in the treatment with preadaptation than in the respective treatmment without preadaptation, showing that preadaptation can prolong survival of this strain in soil. These results indicate that the medium used to pre-grow Salmonella before inoculation into soil influenced the ability to survive in soil in a strain-specific manner. Therefore, conditions which bacteria encounter before their introduction into the environment might have a major influence on their survival and should be considered also with respect to comparability between studies. Furthermore, in this thesis it was analyzed whether survival of S. Typhimurium LT2 inoculated into soil and colonization of lettuce plants by this strain is fostered by addition of sewage sludge or the plant-parasitic nematodes Meloidogyne hapla or Pratylenchus crenatus to soil. Unexpectedly, higher counts of cultivable S. Typhimurium LT2 were observed in untreated soil compared to soil with sludge. There were no differences in numbers of cultivable Salmonella in samples with nematode inoculation compared to control samples. No S. Typhimurium LT2 was detected in any of the leaf samples of lettuce plants grown in soil that was inoculated with S. Typhimurium LT2 after 21 and 49 days; neither in the samples where sludge or nematodes were added to the soil nor in the respective controls, indicating that the presence of sewage sludge or nematodes in soil did not foster colonization of lettuce plants by S. Typhimurium LT2. This suggests that the presence of Salmonella in soil even in relatively high concentrations and after addition of sewage sludge or plant-parasitic nematodes does not necessarily lead to a contamination of the aboveground part of plants by internalization through the roots. The application of sewage sludge to soil was also analyzed with respect to the dynamics of the bacterial soil community as well as its associated mobile genetic elements (MGEs) and antibiotic resistance genes (ARGs) in a microcosm experiment over the course of four months. Comparison of the microbial diversity and relative abundances of ARGs in soil samples with sewage sludge compared to control soil revealed increased relative abundance of plasmids, integrons, transposons and resistance genes that in some cases were still detectable after four months. Soil bacterial communities showed reduced richness and diversity compared to control soil but differences decreasing with time. Resistance plasmids were captured directly from sewage sludge in Pseudomonas putida. The majority of the plasmids isolated belonged to the broad host range IncP-1 plasmids. Altogether, this thesis extends the knowledge of factors influencing the fate of Salmonella in the soil - plant environment demonstrating that the fate of Salmonella in the environment of plants is very complex with many factors influencing its survival. Upon author request this thesis is available as printed version only.
Frisches Obst und Gemüse sind Teil einer gesunden Ernährung. Jedoch können diese Frischeprodukte, wenn sie roh verzehrt werden und mit Humanpathogenen kontaminiert sind, Krankheiten beim Menschen verursachen. Kontaminationen von Frischeprodukten mit bakteriellen Humanpathogenen wie Salmonella enterica können entlang der gesamten Produktionskette auftreten, und eine mögliche Kontaminationsquelle ist der Boden. Die Rhizosphäre und Phyllosphäre von Pflanzen sowie der Boden sind sehr heterogene Habitate, deren Bedingungen sich schnell verändern können, und das Überleben von Humanpathogenen in dieser Umwelt wird von vielen biotischen und abiotischen Faktoren beeinflusst. Bislang ist vieles über die Ökologie von Salmonella in der Umwelt noch nicht bekannt und das Ziel dieser Arbeit war es, das Wissen darüber zu erweitern, welche Faktoren die Persistenz von Salmonella in der pflanzlichen Umwelt beeinflussen. In dieser Arbeit wurden in Mikrokosmos- und Gewächshausversuchen Faktoren untersucht, die das Überleben von Salmonella unter definierten Bedingungen beeinflussen können. Kopfsalat (Lactuca sativa cv. Tizian) wurde als Modellpflanze verwendet und Salmonella enterica serovar Typhimurium Stamm LT2 als Modellhumanpathogen. S. Typhimurium LT2 wurde in den Boden inokuliert und das Überleben mithilfe kultivierungsabhängiger und -unabhängiger Methoden verfolgt. Zu den in dieser Arbeit untersuchten Faktoren gehört der Einfluss der Präadaption, d.h. der Bedingungen, denen Bakterien vor dem Einbringen in die untersuchte Umwelt ausgesetzt sind, auf das Überleben von S. Typhimurium LT2 sowie auf S. Typhimurium Stamm 14028s und S. enterica Serovar Senftenberg. In Mikrokosmosexperimenten wurde gezeigt, dass die Anzahl kultivierbarer Zellen von S. Typhimurium LT2 nach Präadaption signifikant höher im Vergleich zur Kontrolle ohne Präadaption war. Dies zeigt, dass Präadaptation das Überleben dieses Salmonella-Stamms im Boden fördert. Die Ergebnisse liefern einen Hinweis darauf, dass das für die Anzucht der Zellen für Inokulationsexperimente verwendete Medium einen stammspezifischen Effekt auf das Überleben im Boden hat. Das bedeutet, dass die Bedingungen, denen Zellen vor der Inokulation ausgesetzt sind, einen großen Einfluss auf das Überleben von Salmonella haben können. Im Hinblick auf die Vergleichbarkeit der Ergebnisse verschiedener Studien ist dieses Ergebnis von Bedeutung. Des Weiteren wurde die Hypothese untersucht, dass das Überleben von S. Typhimurium LT2 im Boden und die Besiedlung von Kopfsalatpflanzen mit S. Typhimurium LT2 aus kontaminiertem Boden durch die Behandlung des Bodens mit Klärschlamm oder die Inokulation der pflanzenparasitären Nematoden Meloidogyne hapla oder Pratylenchus crenatus in den Boden gefördert wird. Entgegen der Erwartung, dass Klärschlamm durch zusätzliche Nährstoffe das Überleben von Salmonella fördert, wurde jedoch eine höhere Anzahl kultivierbarer S. Typhimurium LT2 im unbehandelten Boden gefunden als im Boden, der mit Klärschlamm behandelt wurde. Zwischen Proben von Boden, der mit Nematoden inokuliert wurde, und Kontrollboden wurde kein Unterschied in der Anzahl kultivierbarer S. Typhimurium LT2 gefunden. In keiner der Blattproben, die nach 21 oder nach 49 Tagen von Kopfsalatpflanzen aus Boden mit Klärschlamm, mit Nematoden oder aus den jeweiligen Kontrollböden genommen wurden, wurde Salmonella detektiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gegenwart von Klärschlamm oder Nematoden im Boden nicht die Besiedelung von Kopfsalatpflanzen mit S. Typhimurium LT2 fördert und dass auch hohe Konzentrationen von S. Typhimurium LT2 im Boden nicht unbedingt zur Kontamination der oberirdischen Teile der Pflanze durch Internalisierung über die Wurzeln führen. Da vermutet wurde, dass das geringere Überleben von Salmonella im Boden, der mit Klärschlamm behandelt wurde, auf die konkurrierenden Mikroorganismen zurückzuführen war, erfolgte eine kultivierungsunabhängige Analyse der Behandlung des Bodens mit Klärschlamm im Hinblick auf Veränderungen der bakteriellen Gemeinschaft im Boden sowie mobiler genetischer Elemente (MGE) und Antibiotikaresistenzgene (ARG) in einem Mikrokosmosexperiment über vier Monate. Ein Vergleich der Diversität und Häufigkeit von ARGs in Bodenproben mit Klärschlamm im Vergleich zum unbehandelten Boden zeigte eine erhöhte relative Abundanz von Plasmiden, Integrons, Transposons und Resistenzgenen, die teilweise auch nach vier Monaten detektierbar waren. Die bakteriellen Gemeinschaften im Boden zeigten nach Behandlung mit Klärschlamm verringerte Diversität im Vergleich zum Kontrollboden, und die Unterschiede wurden im Verlauf des Versuchs geringer. Resistenzplasmide aus Klärschlamm, die auf das Gammaproteobacterium Pseudomonas putida übertragbar sind, wurden mithilfe der exogenen Plasmidisolierung aus Klärschlamm extrahiert. Die isolierten Plasmide gehörten mehrheitlich zur Inkompatibilitätsgruppe IncP-1, die einen breiten Wirtsbereich hat. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit das Wissen über die Faktoren, die das Überleben von Salmonella in der pflanzlichen Umwelt und im Boden beeinflussen, erweitert und gezeigt, dass das Schicksal von Salmonella in der Umwelt sehr komplex ist und viele Faktoren das Überleben beeinflussen. Auf Wunsch des Autors / der Autorin ist diese Dissertation nur als Druckausgabe verfügbar.
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