Vergleichende Untersuchung zur Wirtsadaption des Escherichia coli O104:H4 Ausbruchsstammes des Jahres 2011 mit Zellen von Mensch und Rind

Stalb, Sarah Annette GND

Der Sprossen-assoziierte EHEC-Ausbruch von 2011 wurde von einem neuartigen und hochgradig virulenten E. coli-Stamm verursacht, der Virulenzeigenschaften von STEC und EAEC kombinierte. Klassische STEC-Stämme sind an das Rind adaptiert und modulieren die bovine Immunantwort für eine dauerhafte und asymptomatische Kolonisation. Hingegen wird als natürliches Reservoir von EAEC-Stämmen der Mensch vermutet, da die Isolation typischer EAEC-Stämme bisher hauptsächlich aus dem Menschen erfolgte. Vergleichbar schwere EHEC-Ausbrüche könnten jederzeit auftreten. Allerdings ist aufgrund der Hybridvirulenz des Ausbruchstammes die Herkunft und das natürliche Reservoir nach wie vor unbekannt. Wir wollten die relative Wirtsadaption des Hybridstammes an Mensch und Rind klären, um die Fähigkeit des Hybridstammes zur Persistenz im bovinen Reservoir abzuschätzen. Im natürlichen Reservoir bildet sich ein Gleichgewicht zwischen den Virulenzfaktoren des Erregers und der Immunantwort des Wirts aus. Ist der Hybridstamm nicht ans Rind adaptiert, erwarten wir im Vergleich zu bovin assoziierten Stämmen eine weniger effektive Immunmodulation und mehr proinflammatorische Aktivität im bovinen Wirtszellsystem sowie eine erhöhte Expression von Virulenzgenen bei Wirtszellkontakt. In-vitro untersuchten wir vergleichend die Interaktion des Hybridstammes mit intestinalen Epithelzellen von Mensch und Rind. Dabei wurden das Adhäsions- und Invasionsvermögen sowie das Potential des Hybridstammes zur Modulation der Wirtszellantwort von Mensch und Rind bestimmt, sowie die Expression von Virulenzfaktoren. Das Reaktionsprofil des Hybridstammes wurde vergleichend zu human und bovin assoziierten E. coli-Stämmen klassischer Pathovare oder avirulenten Stämmen bewertet. Als Modell für die lokale Immunmodulation im Rind wurden primäre Makrophagen mit konditionierten, steril filtrierten Überständen aus der Koinkubation von E. coli mit Epithelzellen stimuliert. Das Potential zur systemischen Immunmodulation im Rind wurde ex-vivo untersucht. Der Hybridstamm war fähig, die intestinalen Epithelzellen von Mensch und Rind jeweils aus Dünn- und Dickdarm zu kolonisieren. Elektronenmikroskopisch zeigte der Hybridstamm jedoch eine starke Affinität zu humanen Dünndarmzellen, im Gegensatz zu wenig direktem Zellkontakt mit bovinen Dünndarmzellen. Der Hybridstamm zeigte ein hochgradiges Adhäsionsvermögen, vergleichbar mit human assoziierten Stämmen. Im Gegensatz zum Hybridstamm adhärierten die bovin assoziierten STEC-Stämme geringer an die Wirtszellen. Weiterhin war der Hybridstamm im Unterschied zum invasiven Phänotyp einiger bovin assoziierter STEC-Stämme nicht invasiv. Ähnlich wie kommensale und human assoziierte E. coli-Stämme induzierte der Hybridstamm in humanen Wirtszellen nur wenig proinflam-matorische Aktivität. Erst verzögert nach 6 h zeigte der Hybridstamm proinflammatorische Aktivität im humanen Wirtszellsystem, aber in geringerem Ausmaß als andere Pathovare. Hingegen induzierte der Hybridstamm im bovinen Wirtszellsystem starke proinflammatorische Effekte, zunächst vergleichbar mit dem human assoziierten EAEC-Stamm 55989. Verzögert nach 6 h verursachte der Hybridstamm die stärkste proinflammatorische Aktivität von allen untersuchten E. coli-Stämmen. Auch in den bovinen Makrophagen induzierte der Hybridstamm indirekt einen stark proinflammatorischen Zellzustand. Bovin assoziierte STEC-Stämme verhinderten eher die Entstehung einer proinflammatorischen Reaktionslage in bovinen Epithelzellen und Makrophagen. Der Hybridstamm exprimierte die Virulenzfaktoren verstärkt bei Wirtszellkontakt mit Dünndarmzellen, unabhängig der Wirtspezies und trotz seiner Hybridvirulenz vergleichbar zu anderen Pathovaren. Unter den Stx2-positiven Stämmen war die Stx-Sekretion des Hybridstammes vergleichbar zum EHEC-Stamm 86-24 und stärker als beim bovin assoziierten STEC-Stamm. Absolut sekretierte der Hybridstamm weniger oder ähnlich viel Stx wie die klassischen human assoziierten EHEC-Stämme, aber die Stx-Induzierbarkeit bei direktem Wirtszellkontakt war am stärksten ausgeprägt beim Hybridstamm. Die Zytotoxizität des Hybridstammes war vergleichbar zu anderen Pathovaren und stärker als die avirulenter E. coli-Stämme. Wie human assoziierte Stämme beeinträchtigte die Infektion mit dem Hybridstamm nicht die Permeabilitätsbarriere bei humanen, polarisierten Darmepithelzellen. Die beobachteten Reaktionsmuster aller in dieser Arbeit getesteten Stämme waren sehr heterogen. Trotz der Fähigkeit zur Stx-Produktion und Kolonisation der bovinen Zellen in-vitro und in-vivo scheint der Hybridstamm eher an den Menschen als an das Rind adaptiert zu sein. In Übereinstimmung damit eliminierten experimentell infizierte Kälbern den Hybridstamm effizienter als den EHEC-Stamm 86-24. Insgesamt ergaben sich aber weniger deutliche Unterschiede im Reaktionsmuster des Hybridstammes zu dem von Stämmen, die andere Pathovare repräsentierten, oder auch zu denen avirulenter E. coli-Stämme als vermutet. Bei zukünftigen Ausbrüchen mit seltenen EHEC-Stämmen und neuartigen Virulenzprofilen sollten deshalb auch mögliche tierische Infektionsquellen in Betracht gezogen werden, um eine frühzeitige Eindämmung der Epidemie zu ermöglichen.

In 2011, Germany was struck by the largest outbreak of hemolytic uremic syndrome caused by a novel and highly virulent E. coli O104:H4 strain, combining virulence factors from both enteroaggregative E. coli (EAEC) and Shiga toxin (Stx)-producing E. coli (STEC). Cattle are the primary reservoir for STEC, which are capable of modulating the bovine immune system to promote a persistent and asymptomatic lifestyle. EAEC are considered highly adapted to humans, since they have rarely been detected in animals before. Due to the hybrid virulence profile, the natural reservoir of the outbreak strains remains obscure; however, outbreaks of comparable severity may occur again. This study aimed at appraising the relative level of host adaption of E. coli O104:H4 outbreak strain to possible reservoir hosts. Virulence factors of bacterial pathogens counteract elements of the immune control in the natural reservoir, generating a balance between pathogen and host. If cattle are not the reservoir of E. coli O104:H4 outbreak strain, we expect a less effective modulation of the bovine immune response as compared to bovine-associated E. coli strains. If the E. coli O104:H4 outbreak strain is not adapted to cattle, its interaction with bovine host cells might lead to a high-level of pro-inflammatory activity and overwhelming expression of virulence factors. Therefore, we investigated the interaction of the E. coli O104:H4 outbreak strain with intestinal epithelial cells (IEC) of human and bovine origin. We assessed the outbreak strain’s potential to adhere to and invade into host-specific IEC, as well as its capacity to modulate the host gene expression of selected cytokines. Furthermore, expression of bacterial virulence genes after host cell contact was quantified. The outbreak’s strain reaction profile was compared to both bovine- und human-associated E. coli strains; the latter were representative of different pathovars or non-pathogenic E. coli. In addition, we evaluated the outbreak strain’s immunomodulatory capability by stimulating primary, bovine macrophages with conditioned supernatants from previous infection studies with E. coli and intestinal epithelial cells. Finally, we assessed the outbreak strain’s potential to suppress the development of an adaptive, antigen-specific cellular immune response in cattle in comparison to bovine-associated STEC. The outbreak strain was able to adhere to intestinal (jejunal and colonic) epithelial cells (IEC) of human and bovine origin. Electron microscopy of infected cells revealed the strain’s great affinity to human small intestinal cells, in contrast to few direct interactions with bovine small intestinal cells. The outbreak strain possessed a high-level of adhesive power, similar to human-associated E. coli strains and in contrast to bovine-associated STEC strains. The bovine-associated STEC strains exerted low levels of adhesion to host-specific IECs. The outbreak strain displayed a non-invasive phenotype, in contrast to some bovine-associated E. coli strains which invaded into the host cells. During the initial interaction with human host cells, the outbreak strain induced only little inflammatory cell response, comparable to the extent of commensal bacteria and human-associated E. coli strains. After a prolonged incubation period (6 h), the outbreak strain provoked some pro-inflammatory activity in human cells, but to a lower extent as compared to other pathogenic E. coli strains. The outbreak strain induced marked pro-inflammatory activity interacting with bovine host cells. During the interaction with bovine cells, the outbreak strain initially induced an inflammatory cell response comparable to EAEC strain 55989. The outbreak strain induced the strongest delayed inflammatory response of all strains tested (i.e. after 6 h of co-incubation). In addition, the outbreak strain was capable of indirectly inducing a strong pro-inflammatory activity in bovine macrophages (by transfer of conditioned epithelial cell culture supernatants), which served as model for the innate immunity of the bovine gut. In contrast, bovine-associated E. coli strains limited the pro-inflammatory activity in bovine IEC and macrophages. The outbreak strain, like other pathogenic E. coli strains, enhanced the expression of virulence-associated factors after adhesion, especially after adhesion to small intestinal cells and fairly independent of the host species of the cells. Among Stx2-positive strains, the outbreak strain and EHEC strain 86-24 released comparable levels of Stx and both human-pathogenic strains released higher amounts of Stx compared to bovine-associated STEC. In total, the Stx secretion of the outbreak strain resembled that of other human-associated E. coli strains. However, the outbreak strain displayed the highest inducibility of Stx2 production upon host cell contact. The outbreak strain was capable of eliciting cytotoxic effects in host cells, comparable to other pathogenic E. coli, but in contrast to avirulent E. coli strains. Nevertheless, the outbreak strain was unable to disrupt the polarized monolayer of CaCo-2-cells as well as other human-associated E. coli strains. The reaction patterns observed after interaction of the several strains included in this study with intestinal epithelial cells were strikingly heterogeneous. The E. coli O104:H4 outbreak strain seems to be more likely adapted to humans than to cattle, despite its capacity to produce Stx and transiently colonize bovine IEC in-vitro and in-vivo. This is in accordance with the reduced and shortened fecal excretion of the outbreak strain after experimental infection of calves in comparison to strain 86-24. Nevertheless, overall patterns induced by the outbreak strain were less different from those induced by other pathogenic and even avirulent E. coli strains than anticipated. Health authorities should not prematurely exclude animals as an infection source when taking appropriate early intervention measures during future outbreaks with rare EHEC strains or strains with novel virulence profiles.

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Stalb, Sarah: Vergleichende Untersuchung zur Wirtsadaption des Escherichia coli O104:H4 Ausbruchsstammes des Jahres 2011 mit Zellen von Mensch und Rind. Gießen 2017. Justus-Liebig-Universität Gießen, Fachbereich Veterinärmedizin, Institut für Hygiene und Infektionskrankheiten der Tiere.

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