Herstellung neuer Orf Virus- (Parapoxvirus) Rekombinanten und Analyse deren protektiven und immunrelevanten Eigenschaften

Rohde, Jörg GND

Das Orf Virus (ORFV) gehört zur Gattung Parapoxvirus der Poxviridae. ORFV zeichnet sich durch äußerst vorteilhafte immunstimulierende und protektive Eigenschaften aus, die es für den Nutzen als vielversprechende rekombinante Vektor-Vakzine interessant machen. Die vorliegende Arbeit umfasst die Neu- und Weiterentwicklung von ORFV-Rekombinanten und die Charakterisierung deren protektiven Eigenschaften sowie die Beschreibung von potentiellen neuen Evasionsmechanismen und immunrelevanten Eigenschaften von ORFV. Zur Herstellung und Selektion von ORFV-Rekombinanten wurden verschiedene Methoden der Transfektion optimiert, um in ORFV infizierten Zellen eine höchst mögliche Transfektionseffizienz zu erreichen. Die Etablierung der PCR für den Selektionsprozess neuer Rekombinanten löste das Problem der Abhängigkeit von Antikörpern, die gegen das inserierte Antigen gerichtet sind. Zudem ermöglichte der Einsatz von Fluoreszenz-Markergenen eine Reduktion der Arbeitsschritte, die zum Erhalt homogener Virus-Rekombinanten führen. Des Weiteren wurden verschiedene ORFV-Rekombinanten hergestellt, in deren Genom Fremdgene verschiedener Viren (BRV, BTV, AHSV, FMDV, RHDV und Influenzavirus) eingefügt wurden. Die korrekte Insertion und Expression dieser Gene wurden durch verschiedene molekularbiologische Methoden bestimmt und die protektiven Eigenschaften einiger Rekombinanten wurden in vivo charakterisiert. Die ORFV-Rekombinante D1701-V-VP1 konnte einen effektiven Schutz gegen RHDV im natürlichen Wirt, dem Kaninchen, induzieren. RHDV verursacht eine hochansteckende Erkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate in Kaninchen. Da in vitro Zellkultursysteme fehlen, stammen kommerzielle Impfstoffe aus der Leber von RHDV infizierten Kaninchen. Bereits eine singuläre Immunisierung mit der Rekombinanten D1701-V-VP1 war ausreichend, um eine vollständige Immunität gegen eine letale RHDV Infektion in Kaninchen zu induzieren. Der induzierte Schutz beruhte neben der spezifischen Antikörperantwort gegen RHDV vermutlich auch auf einer Beteiligung von T-Zellen. Die generierte ORFV-Rekombinante stellt eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Vakzinen dar. Eine weitere neu hergestellte Rekombinante (D1701-V-HAh5n) exprimiert das Hemagglutinin (H5 HA), welches das Hauptimmunogen des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) Stamm H5N1 darstellt und virus-neutralisierende Antikörper induziert. Die Immunogenität dieser ORFV-Rekombinante wurde nach Immunisierungen von Mäusen mit anschließenden Belastungsinfektionen verschiedener Stämme des HPAIV H5N1 charakterisiert. Die immunisierten Tiere zeigten nach Infektion weder eine klinische Symptomatik noch einen Verlust an Körpergewicht. Zudem waren vakzinierte Mäuse auch vollständig gegen das heterologe humane Influenzavirus A Stamm H1N1 geschützt. Depletionsversuche in vivo von CD4-positiven und/oder CD8-positiven T-Zellen wiesen darauf hin, dass insbesondere CD4-positve T-Zellen für die Ausbildung der protektiven Immunität notwendig waren. Die in vivo Untersuchungen der protektiven immunologischen Charakteristika von ORFV-Rekombinanten, welche die Glykoproteine des Pseudorabiesvirus (PRV) exprimieren, zeigten eine ausgeglichene spezifische TH-1 und TH-2 Immunantwort. Bis zu 24 Stunden nach ORFV Immunisierung konnte eine gesteigerte Aktivität von Natürlichen Killerzellen und die Expression pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, IL- 6, TNFα und G-CSF) nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten und nach einer zweiten ORFV Immunisierung war vermehrt die Sekretion von TH-2 spezifischen Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13) im Serum der Tiere nachweisbar. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Interferon-α/β und γ Rezeptoren essentiell für den Schutz vor einer PRV Infektion waren. Pockenviren besitzen ein breites Genspektrum, das eine Umgehung der Immunantwort des Wirts ermöglicht. So wurden die immunmodulatorischen Eigenschaften von ORFV und dessen Einfluss auf den Prozess der Antigenpräsentation über MHC I in infizierten Vero Zellen untersucht. Abhängig von der Infektionsdauer war die MHC I Expression auf der Zelloberfläche bis zu 50% reduziert. Zudem konnte bei infizierten Zellen eine verlängerte Halbwertszeit von vorhandenen MHC I Molekülen an der Zelloberfläche nachgewiesen werden. ORFV scheint die MHC I Oberflächenexpression herab zu regulieren, indem es direkt die Struktur der Golgi Kompartimente und das vesikuläre Transportsystem angreift. Dies wiederum hat Einfluss auf die Präsentation viraler Antigene und die Aktivierung von T-Zellen. Zudem zeigten Analysen eine Ko-Lokalisierung zwischen MHC I und COP-I Vesikeln sowie einen gestörten Glykosylierungszustand von post-ER MHC I Molekülen. Die beschriebenen Arbeiten demonstrieren eindrücklich die bemerkenswerten Eigenschaften des ORFV Stamm D1701-V und dessen großes Potential als Vektor- Impfstoff gegen virale pathogene Erreger.

Dateien

Zitieren

Zitierform:

Rohde, Jörg: Herstellung neuer Orf Virus- (Parapoxvirus) Rekombinanten und Analyse deren protektiven und immunrelevanten Eigenschaften. Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät 2017.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export